高效液相色谱-1.ppt

1、高效液相色谱(1) (HPLC)概述、理论和工具、徐分析室色谱组英特尔： 3426电子邮件3360，1。介绍、基本(包括纸色谱、薄层色谱、柱色谱等)高效液相色谱是采用高压传递迁移相和高效固定相和在线检测等手段的液相色谱。高效液相色谱，高效液相色谱，waters HPLC 717自动小型机，717 plus 600 pump and controller，996 photo diode array，410 deferent ial refractor，in alliance systems，The 2695 is designed to work with both empower and ma

2、ss lynx software，symmetry and xterra columns，and a variety高速是指在分析速度上比经典液相色谱法快数百倍。因为经典色谱是重力充电，所以流出速度很慢。高效液相色谱法配备高压输液设备，流速最高可达103cmmin-1。例如，分离苯的羟基化合物，7个小组只要1min就可以完成。氨基酸分离用经典色谱分离20多种氨基酸，柱长约170厘米，柱直径约0.9厘米，流动速度为30cm3h-1，需要20多小时。采用高效液相色谱法，可在LH内完成。高效液相色谱和气相色谱、气相色谱分析对象仅限于对气体和沸点低的化合物的分析，只占有机物总数的20%。对于有机物总数

3、接近80的高沸点、热稳定性下降、摩尔质量大的物质，目前主要使用高效液相色谱法进行分离和分析。气相色谱法使用流动相是惰性气体，对组分没有亲和力。也就是说，没有产生相互作用力，一般只起到搬运作用。在高效液相色谱法中，流动相可以选择极性不同的液体，选择范围广，参与给组提供亲和力，固定对方组的作用。因此，流相对分离就像添加控制和改善分离条件的参数，这对于选择最佳分离条件非常方便。气相色谱法通常在高温下进行，而高效液相色谱法可以在室温下经常操作。与气相色谱的区别，仪器-方法-操作(样品方法)柱固定相流动相样品(没有挥发性限制)，1.2特征目前，高效液相色谱是生物和医药重要的大分子物质，例如蛋白质、核酸、

4、氨基酸、多糖、植物色素、聚合物、染料和药物高效液相色谱的仪器设备成本高，操作严格是它的主要缺点。1.3发展史，古罗马时代染料和色素分析。1850年德国化学家伦齐的改进发展成了纸谱。1903年在俄罗斯植物学家Tsweet牙齿华沙生物学会议上发表论文(植物色素分离)20多年后，Kuhn和Lederer在蛋黄中用于分离植物叶黄素，证明了方法是可行的。光谱关注了液态高颜色频谱瑞典Tiselius和Claesson 30年代薄层色谱，1941年英国生物化学家马丁和英国化学家Synge(诺贝尔奖)创立液分配光谱以含水饱和度的硅为固定相。将含有乙醇的氯仿作为流动相分离的乙酰氨基酸60年代高压液相色谱发展契机

5、-高压液态泵、光学探测器、悬浮粒子填充物70年代高效固定相、柱技术的发展高压高效电导检测器和离子交换颜色频谱80年代以来相关学科的发展(药、农药、化工、染料)牙齿快速普及的应用颜色频谱专家系统频谱光谱色谱-质谱-质谱可以简单分类如下：根据固定相的聚集状态：液相色谱、液-固色谱分离机制：分配色谱、吸附色谱、离子交换、分子排斥、亲和高效液相色谱一般可分为4茄子主要部分：高压注入系统注入系统注入系统分离系统检测系统；辅助装置：倾斜淋溶自动注入数据处理等。 高压输液泵储液罐过滤器压力脉动电阻器等部分辅助装置脱气倾斜系统，1.5.2注入系统有时用自动取样装置，1.5.3分离系统频谱柱、心脏部件，包括柱管

6、和固定顶柱管在内的不锈钢金属管普通频谱柱长度530厘米，内径25毫米，凝胶光谱柱内径312毫米，准备柱内径大，可达25毫米以上一般在分离之前，先有柱。事先柱内的填充物和分离柱尽可能完全相同。有时包括柱恒温设备、1.5.4检测系统、可选探测器紫外线荧光传记化学检测器等通用探测器差动折射电导检测器。1.5.5辅助系统包括除气梯度清洗柱恒温自动采样分划在内的数据处理等。2 .同时存在的熵增过程，即乐队自发扩散，混合团队。(威廉莎士比亚、熵、熵、熵、熵、熵、熵)色谱学理论台对色谱列的广度(色谱过程动力学)色谱守恒值变化规律(色谱过程热力学)色谱分离条件的选择和最优化，2.1色谱过程动力学-带扩展和柱效

7、应在正常流速下，B 0 C传导电阻抗C=Cm(动态流相)Csm(固定相)对耦合相，Cs=0，因此液相色谱H=A B/u Cmu Csmu Csu对耦合相色谱H=A Cmu Csmu Giddings(3)其他理论、平衡谱理论(塔板理论之前，朗格缪)纵向扩散理论(速度理论之前)块液膜模型计量交换模型非平衡颜色频谱理论等，柱外效应、取样器连接管连接感应池其他，柱外效应(柱外宽度)是指频谱柱外的因素。高效液相色谱法频谱柱比气色频谱柱短得多，因此柱外的宽度比较突出。主要包括存在于以下系统中的死体积：2.2 .颜色频谱过程热力学-颜色频谱保留和可选性，(1)容量系数K=(TR-t0)/T0平衡常数K=组

8、固定相浓度/组流动相浓度=k=颜色频谱柱内流动相占用体积/固定相占用体积k=K/直接组热力学常数和分子反相色谱法甲醇、乙腈、四氢呋喃、晶体相色谱法(相反)水、甲醇、丙酮、氯仿、苯、己烷、溶剂的强度和极性、溶剂的选择性、Snyder是溶剂和样品分子之间的作用力作为溶剂选择性的基础。在液体固色法中，K对温度变化不如气色波敏感。因此，流动相线速度确定后，影响分离效果分离时间的主要因素是流动相配置。通过统计热力学方法，可以导出二元流动相体系中组容量系数K和强溶剂浓度CB之间的以下关系：lnk=a blnCB cCB在包含强溶剂B1，B2的三元流动相体系中，lnk=a b1lnCB1 c1CB1 b2l

9、nCB2 c2CB2表达式中的a、b、c几乎可以视为常量。2.3色谱分离条件的选择混合物分离，(1)最优化参数和最优化指标最优化色谱参数：适当的检测仪选择，分离模式，色谱仪，流动相组成等实际上主要是流动上各种有机溶剂的浓度，缓冲液的类型，浓度和流动相组成，包括PP最优化指标：分离度，流动相组成a计算化学法(数学优秀法)三角法(主要是四面体法)图解法(窗图法、叠侵权法等)直接法(简易法、复合刑法、迭代设计法等)，还设有梯度浸出、自动取样和数据处理等辅助装置。工作过程如下：首先，高压泵通过取样器向彩色频谱柱供给从储液罐流出的溶剂，然后从控制器的出口流出。在注入要分离的样品时，通过注入器存储器流动的

10、流动相同时将样品导入频谱柱中分离，然后依次进入探测器，记录器记录探测器发送的信号，从而获得液体光谱。(David aser，Northern Exposure，美国电视电视剧，Northern Exposure)，3.1高压水液系统，高效液相色谱法的固定相颗粒很细，因此对流动的阻力很大，因此必须配备高压水液系统，使流动相快速流动。是高效液相色谱法系统最重要的部件，一般由储油罐高压液泵过滤器压力脉动电阻器等组成，(1)液液系统和流动相、A流相、脱气及储液溶剂的基本要求：不损害柱的稳定性，纯度足够(防止柱污染，提高检测灵敏度)。与探测器匹配(区分流动阶段和样品，以提高检测灵敏度。)对样品有一定的溶

11、解力。准备色谱应有助于样品回收(易蒸发，碱性氧化铝柱不使用丙酮，防止缩醛)，溶剂过滤，防止磨损活塞泵的单向阀和密封圈(影响精度，泄漏)，防止管道和不锈钢烧结板堵塞。方法：一般使用直径为0.45或0.22um的微孔过滤器进行过滤，以确定不同过滤器对不同溶剂的适用性。溶剂脱气，原因：泵产生气泡，导致流速不稳定，传感器噪音增加，响应降低，信号消失。(在出口，液体压力减少，熔化的气体进入泡沫，影响探测器的工作，形成不规则的假峰。)溶解氧提高紫外线检测器基线，低波长检测时信号抵消。荧光探测器关闭荧光，灵敏度下降。返回原型的传记化学探测器也不能有氧气。此外，还可以切断耦合相硅的耦合链。溶剂脱气方法：1 .

12、氦脱气，氦在流动相中的溶解度很低，可以慢慢通过流动相驱逐溶解的空气。如果使用得当，10分钟内可以去除80%到90%的溶解气体，持续渗透可以防止空气的再利用和反扩散。正常流速(30ml/min)牙齿开始，4ml/min牙齿保持不变。2.真空脱气。贮气器真空，熔化的气体蒸发，气泡逸出，其效果仅次于氦气脱气。可以与提取一起使用，但效果不好。3.超声波除气，只能去除30%的气体，对过饱和溶液更有效，可以与真空除气相结合。4.加热回流脱气。最有效的脱气方法不适合混合流化床。5.在线脱气方法。流动相允许通过带微孔的特殊塑料管道，只允许溶解在溶剂中的气体从管壁渗透，流动相只能在管内通过，最终达到在线脱气的目

13、的。通常是500-1000毫升的玻璃或石英玻璃瓶。一般溶剂瓶必须不定期销毁。专用低液气也要定期清洗，防止污染。B高压泵，基本要求：输出流量稳定(基本无脉冲，准确度和重复性优于0.3%)。密封性好的流量调节范围宽度(分析型通用0.1-10ml/min)；高输出压力(最大40-50 MPa)；压力稳定，死体积小，有利于洗脱液的更换(通常是十几到几十微升)。抗腐蚀。常用注入泵分为恒流泵和静压泵。HPLC主要使用恒流泵恒流泵，在特定操作条件下输出流量保持不变，与颜色频谱柱引起的电阻变化无关。恒流泵、注射器泵、往复泵、隔膜泵等最常用的是往复泵。恒压泵意味着输出压力可以保持不变，但其流量会随着颜色频谱系统电阻的变化而变化，因此保留时间的重要性下降，目前主要用于颜色频谱柱充电。一般为高压泵，a .往复活塞泵b .柱塞隔膜泵c .气动放大泵，a .往复活塞泵泵原理，结构，单向阀，泵密封垫圈。串联泵和并联泵不同于脉冲减少、串联泵、柱塞，并联泵属于一对单向阀，b .柱塞隔膜泵HP 1090，c .气动放大泵以高压空气源为动力，属于静压泵。目前主要用于支柱安装、C梯度洗脱装置、改善复杂混合物(宽度K)分离、缩短分析时间、提高灵敏度。通常流动相溶出强度从弱到强。不使用通用检测设备，如差动折射检测设备。要求：搅拌机体积小，无丝，清洗方便，混合效率高，可提高再现性，减少