生化工艺学第三章.ppt

1、生化工艺学课件第三章 氨基酸的提取分离,第三章 氨基酸的提取分离,3.1 概述 3.2 氨基酸的分类 3.3 氨基酸的理化性质 3.4 氨基酸的主要用途 3.5 氨基酸的提取分离方法 3.6 胱氨酸的提取分离技术 3.7 精氨酸、赖氨酸和组氨酸的制备 3.8 亮氨酸的制备,3.1 概述,发现新氨基酸种类和数量已由60年代50种左右，到现在已突破400种。 在产量方面，60年代初世界氨基酸产量不过10万吨，到2000年年产值达到300亿美元。 氨基酸作为人类营养添加剂、调味剂、饲料添加剂、医药等，在食品工业、农业、畜牧业及人类健康、保健等诸多方面有着广泛的应用。 氨基酸产品的涵义已从传统的蛋白质

2、氨基酸发展到包括非蛋白质氨基酸、氨基酸衍生物及短肽类在内的一大类对人类生活和生产起着愈来愈重要作用的产品类群,各国氨基酸工业现状分析,全世界氨基酸产量达120万t，其中作为调味品及食品添加剂的约占50，饲料添加剂约30，药用和保健、化妆品及其他用途的氨基酸约为20，但世界市场总需求量至少为200万t。,日韩欧美等国都在积极开展重组菌株生产氨基酸技术，如Lys、Thr、Phe、Trp、Arg等，美国则凭借基因重组技术在氨基酸生产方面处于世界前列。,我国的氨基酸工业现状,到2000年，用于输液的十八种药用氨基酸原料，除L丝氨酸和L色氨酸尚不能工业化生产，其他均已投产，国产化率达到80以上。 谷氨酸

3、的产量已达世界最高，接近国际先进水平； 赖氨酸消费主要用于饲料工业，国内自给仅为3540，需求也逐年增长。 L苯丙氨酸通过海因酶法路线，成本明显下降。 已有工业化产品聚合氨基酸和氨基酸型螯合剂等，市场前景看好。,3.2 氨基酸的分类,一、蛋白氨基酸 甘Gly、丙Ala、缬Val、亮Leu、异Ile 脂链 丝Ser、苏Thr、半Cys、蛋Met 羟硫添 天Asp、谷Glu、赖Lys、精Arg、组His 酸碱 脯pro、酪Tyr、苯Phe、色Trp 杂芳环 天冬酰胺Asn、谷氨酰胺Gln 天然蛋白质的构成成分，共20种，大都以结合状态存在，均为L-氨基酸编码蛋白质 据其化学结构分为：脂肪族、芳香族

4、、杂环族氨基酸。 据分子中氨基和羧基的数目不同，分为酸性、碱性、中性,不是蛋白质的组成成分，多以游离形式存在自然界存在的天然产物，且具有独特的生物学功能 可有D型、-氨基酸、-氨基酸 生物体内含氮物质的吸收、储存和运转：高丝、刀豆氨酸 神经传递： -氨基丁酸 体内次生物质的前体：多巴胺、5-羟色胺 至今已发现有450种以上，有药用价值的有100多种,二、非蛋白氨基酸,三、衍生氨基酸,蛋白质分子中，掺入了多肽链的氨基酸，经酶催化修饰后，其活性基团如：-COOH酰胺化、 -NH2甲基化或乙酰化、-OH磷酸化等衍生或修饰氨基酸，主要用于治疗各种疾病 可作为蛋白质分子的组成部分天然存在，也可通过氨基酸

5、化学修饰的方法体外合成 另：根据人体能否合成，分为必需氨基酸和非必需氨基酸（Val、Leu、Ile、 Thr 、 Met、 Trp 、Lys、Phe）、（半必需Arg、His）,3.3 氨基酸的理化性质,一般为白色结晶体，熔点很高，熔融时易分解，可溶于强酸、强碱中 水中溶解度：Arg、Lys最大，胱氨酸、Tyr最小，Pro能溶于乙醇中，乙醚中氨基酸多不溶解 两性解离和等电点（有机溶剂萃取、离子交换等） 成盐反应：与酸碱均可形成可溶于水的盐，与Cu 2、Ag、Hg 2形成不溶于水的盐 与茚三酮显色反应（据产生CO2或颜色的深浅） 氨基酸特殊基团的反应（米伦Tyr、坂口Arg、 Pauly His

6、及Tyr反应）,3.4 氨基酸的主要用途,一、食品工业 众多蛋白质的生物功能与构成蛋白质的氨基酸种类、数量、排列顺序及由其形成的空间构象有密切关系对维持体内动态平衡有极其重要的意义。许多蛋白质具有其特定的药理效应 Cys及Tyr可分别由Met及Phe合成也称为半必需氨基酸；Arg及His合成速率低 Lys对婴幼儿来说：促进钙的吸收，加快骨骼生长，加快生长发育 主食如小麦中缺乏Lys、Thr及Trp应注意适量添加 鲜味：谷氨酸单钠、天冬氨酸钠；甜味：Gly、DL-Ala、L-天冬氨酰苯丙氨酸甲酯,二、饲料工业,不同动物种类和动物不同生长期，其必需氨基酸的种类和数量各有不同。 鸡的必需氨基酸为蛋氨

7、酸、赖氨酸、甘氨酸等13种；猪的必需氨基酸为赖氨酸、蛋氨酸、色氨酸、精氨酸、苏氨酸等10种；鱼类的必需氨基酸为精氨酸、组氨酸、异亮氨酸及亮氨酸等10种。动物机体若缺乏某一种氨基酸，特别是必需氨基酸，将会严重影响正常的生长发育 一般饲料中缺乏Lys和Met适量添加这两种氨基酸可提高饲料的营养价值，促进鸡多产蛋与猪的生长,常用的氨基酸饲料添加剂,氨基酸饲料添加剂由发酵法、化学合成法、酶与化学-酶法等方法工业化生产，主要品种有： L-赖氨酸盐酸盐是赖氨酸的主要商品形式，也是最常用的赖氨酸。 DL-蛋氨酸是最常用的蛋氨酸饲料添加剂。蛋氨酸羟基类似物蛋氨酸羟基类似物又叫羟基蛋氨酸，或MHB。 N-羟甲基

8、蛋氨酸钙是羟基蛋氨酸的钙盐 DL-色氨酸 价格较高，饲料添加剂中较为少用。L-苏氨酸除特殊需要外，饲料中并不常见。,目前生产赖氨酸的方法主要是发酵法。产菌株的选育和最适发酵条件的选择是影响赖氨酸产量和赖氨酸生产效益的主要因素。 谷氨酸棒杆菌AS 1.563是我国选育出的赖氨酸生产菌株。该菌为高丝氨酸营养缺陷型（Hom-或Hser-）、具有耐高赖氨酸等特征。以糖蜜为原料，该菌72h累积产赖氨酸量（产酸量）平均为3.14%。 以AS1.563为出发菌株, 通过亚硝基胍和紫外线照射处理，使菌体发生诱变。筛选出具有抗赖氨酸类似物-S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸(AEC)、高丝氨酸营养缺陷型（Hom

9、-）、耐高糖和耐高赖氨酸的赖氨酸高产菌株-ZL9601菌株。该菌72h累积产赖氨酸量为6.11%,全世界主要的蛋氨酸生产企业为德国德固赛公司、法国Rhonepoulenc公司、美国Novns公司、日本住友化学制药株式会社等，约占世界蛋氨酸产量的90左右。 最大消费市场是饲料添加剂，目前食品及医药用途的消费量占总市场消费份额约不足1。 不同用途的蛋氨酸产品采用的工艺、设备、技术有很大不同。饲料级蛋氨酸生产多为化学合成法，生产工艺是以甘油、丙烯醛、甲硫醇合成，得到的主要是DL-Met。药用输液和食品添加剂蛋氨酸一般以L-Met为主，以DL-Met为原料，采用生物酶拆分法，生产L-Met纯品。,单一

10、构型氨基酸的获取,获得单一构型的氨基酸方法主要有两类： 蛋白质水解、微生物发酵、利用酶或化学不对称合成，直接得到单一构型的氨基酸 通过化学法合成外消旋氨基酸，再进行手性拆分才能得到单一构型的氨基酸 对于D、L型都有应用价值的氨基酸而言，哪种方法更有应用前景？,有些氨基酸化学法合成步骤简单，价格低廉，拆分后的产品组分较前一方法易于分离，拆分时可利用酶法拆分（温和、环保）,三、医药工业,1、个别氨基酸类制剂 1）治疗消化道类疾病的氨基酸及其衍生物： 谷氨酸及其盐酸盐、谷氨酰胺、乙酰谷氨酰胺铝、甘氨酸及其铝盐、硫酸甘氨酸铁、维生素U及组氨酸盐酸盐 2）治疗肝病的氨基酸药物 L-Arg、L-鸟氨酸及L

11、-爪氨酸是机体尿素循环中间体（加速肝脏解高血氨毒）；L-谷氨酸可促进TCA循环，促进血氨下降；蛋氨酸、乙酰蛋氨酸（机体内胆碱合成的甲基供体，促进磷脂酰胆碱的合成）；L天冬氨酸有助于鸟氨酸循环，促进氨和CO2形成尿素，降低血氨和CO2,3）治疗脑及神经系统疾病的氨基酸：谷氨酸钙盐及其镁盐，维持神经肌肉正常兴奋（神经衰弱脑功能衰竭等）；-Tyr(激活体内的葡萄糖代谢，促进乙酰胆碱合成，恢复脑细胞功能)；L-Trp及5-羟色氨治疗抑郁症、精神分裂症及酒精中毒等；左旋多巴治疗帕金森病及控制锰中毒 4）肿瘤治疗：偶氮丝氨酸、氯苯丙氨酸、磷乙天冬氨酸及正氮氧代正亮氨酸等 5）其它：胱氨酸及半胱氨酸（抗辐射

12、损伤、重金属中毒、肝炎等）高半胱氨酸促进核酸代谢及肝细胞再生，预防药物中毒（保肝作用）；乙酰半胱氨酸：呼吸道黏液溶解剂，促进排痰；乙酰羟脯氨酸结缔组织疾患；赖乳清酸肝损伤解毒,二、复方氨基酸制剂,为重症患者提供合成蛋白质的原料，以补充消化道摄入的不足 1）水解蛋白注射液：天然蛋白质酶解或酸解的复方制剂（因含有小肽物质，不能长期大量应用），为复方氨基酸注射液代替（浓度高、体积小、无热源与过敏物质） 2）复方氨基酸注射液：多种氨基酸据需要按一定比例配置而成，有时加入高能物质、微生素、糖类及电解质 3）要素膳：由多种氨基酸、糖类、脂类、维生素、微量元素等组成，经口或鼻饲为病人提供营养的代餐制剂,氨基

13、酸输液： 营养输液、代血浆用输液、止血用氨基酸输液、婴幼儿用氨基酸输液、治疗用氨基酸输液（94年1000万瓶，2000年则达1亿瓶）；氨基酸口服液 氨基酸聚合物新的外科材料（以亮氨酸和酯化的谷氨酸或天门冬氨酸共聚而成的仿天然皮肤的层状伤口裹敷物 ） 多肽类药物如谷胱甘肽是一种用于治疗肝病、药物中毒、过敏性疾病及预防白内障的有效药物 氨基酸衍生物还可作为抗生素和抗菌增效剂、抗肿瘤药物,医药用氨基酸归类,3.5 氨基酸的提取分离方法（天然）,一、蛋白质水解： 酸水解（610mol/L HCl or 4mol/L H2SO4）高温水解1224h除酸。优点：水解完全，不引起消旋，Trp全部被破坏，Se

14、r、Tyr部分破坏，腐蚀设备，为工业常用方法 碱水解：6mol/L NaOH or 2mol/L Ba(OH)2，100度6h，水解完全，Trp不遭破坏，不腐蚀设备，但氨基酸发生消旋反应，Ser、Thr、Arg、Cys大部分被破坏少用 酶水解法：胰酶、胰浆、微生物蛋白酶，反应条件温和、不破坏氨基酸、不消旋、设备简单但水解不完全，中间产物如肽类较多，易染菌常用于制备蛋白胨、水解蛋白，在氨基酸生产中应用较少,水解是否完全？,常采用缩二脲法检测，若无典型显色反应则表示水解完全 因为缩二脲反应是肽键的特征反应，即蛋白质或多肽中的肽键在碱性条件下，与Cu 2产生紫红色络合物。 只有具有肽键的2肽或以上的

15、多肽、蛋白质才有这一特征反应，若蛋白质完全水解了，则无缩二脲反应,二、氨基酸的分离及精制,1、溶解度或等电点分离 水及乙醇中溶解度的差异。eg.Cys及Tyr水中难溶，Tyr热水中易溶，而Cys仍难溶，结合等电点 2、利用沉淀法：与有机或无机化合物结合，生成特殊性质的结晶性衍生物（eg.组氨酸氯化汞） 3、利用离子交换法分离（调氨基酸水解液至pH2过阳离子交换树脂升高pH分部收集洗脱液洗脱液茚三酮显色定量测定） 根据氨基酸的溶解度和等电性质选择条件，调pH至等电点附近，采用结晶的方法来提高纯度,3.6 胱氨酸的提取分离技术,Cysteine/Cystine，胱氨酸比半胱氨酸稳定 Cystine

16、：六角形片状白色结晶，无味，微溶于水，不溶于乙醇及其他溶剂，易溶于稀酸、碱液中，热碱液中易分解 促进毛发生长、防止皮肤老化，临床上用于治疗膀胱炎、秃发、肝炎、神经痛、中毒症、放射损伤及各种原因引起的巨细胞减少症。 在毛发中广泛存在，人发中最多17.6% 最难溶于水的氨基酸：废旧杂毛酸水解 结构式：HOOC-CH-CH2-S-S-CH2-CH-COOH,一、试剂与器材,1、原料：干燥的人发或猪毛 2、试剂及配制：各种试剂、规格及作用,3、器材：玻璃钢水解罐、耐酸锅、陶瓷缸、不锈钢桶；恒温水浴、温度计；布氏漏斗、垂熔漏斗、砂芯漏斗、离心机；酸度计,二、提取工艺,工艺流程：,水解,三、注意几点,1、

17、水解终点的判定： 收率基本稳定在3-4%，平均最高收率7-8%主要取决于毛发的水解程度，水解是否完全采用双缩脲法测定 蛋白质分子中的肽键在碱性条件下，与Cu 2产生紫红色络合反应，与缩二脲在碱性条件下与Cu 2的反应相似 2、酸浓度高及水解时间： 酸浓度，水解速率；水解时间也很关键：时间短则水解不彻底；时间长则氨基酸被破坏,3、温度的控制： pH调至4.8 4、如何提高产率： 提取率多在4-8%，人发提取率较高，生产过程中提取不完全、损失大。关键：水解、中和及过滤，水解时，水解罐应装有回流装置。 5、产品规格及含量测定： 规格：外观、熔点、比旋光度、干燥失重、澄明度、氯化物测定、残渣测定、重金

18、属检测、铁盐检测、酪氨酸检测 含量测定：溴量法(氨基酸分析仪、液相色谱费用较高) Br2Br- ；Br- +KII2 ；淀粉指示： I2 Na2S2O3,溴量法易受多种因素的影响,如水解液色泽较深,影响到对淀粉指示剂变色点的判断、凡能氧化碘化钾的物质如C2+、F3+都严重干扰测定,溴亚铁法采用二苯胺磺酸钠作指示剂,颜色由绿色变为紫色,样品本身的颜色对变色点的判断影响相对较小,3.7 Arg、Lys、His的制备,Lys必需，Arg、His半必需 Lys必需，用于治疗营养缺乏症、发育不全及氮平衡失调症，食品饲料强化剂，尤其用于儿童食品 Arg与脱氧胆酸制成复合制剂（明诺芬）：主治梅毒、病毒性黄疸等 His：治疗心脏病、贫血、风湿性关节炎和消化道溃疡 等电点分别为9.74、10.76、7.59,制备工艺,最后的精制步骤包括：减压浓缩升温脱氨、升温活性炭脱色、减压升温浓缩、冷至室温结晶析出,pH？,注意：流出先后顺序及检测方法,3.8 亮氨酸的制备,L-leucine，白色结晶，无嗅、味苦，易溶于水，