用层析法分离、复性包涵体

1、用层析法分离、复性包涵体谷振宇 Jan-Christer Janson 苏志国中国科学院过程工程研究所摘要 这里提出了一种用柱层析直接从Ecoli破碎原浆中分离纯化及复性包涵体的新方法。将传统的离心分离一步凝胶过滤所取代。分离的原则是选择合适的介质，使之仅排阻包涵体颗粒，而其它的组份都可以进入并穿过凝胶介质。在新的复性方法中，逐步递减的变性剂(urea或Gu-HCl) 梯度与逐步递增的pH梯度相结合，通过凝胶过滤(排阻上限小于蛋白质分子量) 层析来进行复性。溶解在高浓度变性剂及低pH中的变性样品， 然后加入到梯度形成好的层析柱中。在层析过程中，变性蛋白质的下行速度大约是变性剂下行速度的3 倍。

2、因此，变性蛋白会经过已经形成好的变性剂和pH梯度，并逐步脱除变性剂，逐步地升高pH，这样可以促进正确的折叠。梯度的形状和程度，及流速都会影响复性率，而且可以针对不同蛋白质进行调节，以得到优化的条件。我们在此实验中选择的目标蛋白质为大肠杆菌表达的scFv 融合蛋白包涵体。Rudolph和Lile的综述已经对蛋白质的体外复性做详细的介绍1。传统的分离、复性方法如：分步离心，稀释和透析通常很耗时且复性率低。本文中介绍了以凝胶过滤为基础发展起来的分离及复性方法。此方法的一个优势是变性剂的脱除，流速及pH的变化可以很容易的调节。大肠杆菌表达的scFv 融合蛋白质包涵体。ScFv 片段在Eocli 中表达

3、量很高，但经常会形成包涵体。因此需要进行复性。材料与方法 脲(urea )、DTT、PMSF、溶菌酶(lysozyme)、精氨酸 (arginine)、Triton X-100和DNAse购于Sigma。GSSG，GSH购于Roche。Berol 185 购于Akzo Nobel 表面化学公司，Sweden。所有层析介质均为Amersham Pharmacia Biotech公司产品。其它试剂均为分析纯。实验用水为Millipore 纯水系统生产。所有层析实验在AKTA Explorer 层析工作站上进行。用于scFv57P 活性检测的Biacore 2000 为Biacore(Sweden)

4、 公司生产。电泳设备采用Amersham PharmaciaBiotech 公司的PhastSystem 电泳设备。克隆与表达scFv57P Fab57P 的scFv 抗体片段是通过VH-linker-VL 的走向构建成pscFvHL57P 2。载体选择用pscFew，它有一段可以使蛋白质表达到周质的pelB 引导序列；一个15-aa linker,VH-SRGKSSGSGSESKST-VL，来连接抗体可变区的两个domain；C-terminal 的B10tag 用于免疫识别3 。在pscFvHL57P 中VH domain 被设计成XhoI-XbaI 位点，PCR扩增目标片段，VL dom

5、ain 被设计成SacI-SpeI 位点。PCR扩增目标片段。 ScFv57P 抗体片段通过前人的方法表达在E.coli 中4。通过Western blot鉴定（用抗B10的抗体），发现表达的scFv57P形成对还原剂敏感的聚集体。经BIAcore 鉴定细胞周质提取物原液，发现活性抗体片段的产量为5-10 g/l5。在pBAD/Thio-TOPO 中克隆及过量表达scFv57P 以质粒pscFvHL57P为模版，将编码scFv57P的目的片段基因用PCR扩增。正相引物为(5- acactgggatccatggcccaggcccaggtgaaactgctcgag-3），其中包含了T7 RNA p

6、olymerase的增强子和scFv57P 中Vh的起始基因片段(下划线部分)。反相引物为5- cacgatgcggccgctcgagtcgactaaacgttcgcgaccgccctgacg- 3 用来保持原始pscFvHL57P 构建的C端的B10 tag (下划线部分）。扩增产物在N端多出4 个氨基酸，在C 端多出8个氨基酸(在B10 tag之后)，这是为了增加了几个不同的单一的酶切位点，简化后继的克隆表达。PCR 过程如下：95 (1 min) - 43 (1 min) - 72 (2 min), 30个循环。然后根据产品手册中的说明将扩增的目标基因直接嵌入pBAD/ThioTOPO

7、（Invitrogen company) 质粒载体中，然后转化入TOP10 E.coli 宿主菌细胞内。在最终scFvHL57P 在N 端与thioredoxin (Trx) 融合在一起(Fig. 1B) 并包括一个源于pscFvHL57P 的B10 tag，V5tag，GKPIPNPLLGLDST 和在C 端的一个源于pBAD/Thio-TOPO 的6*His 的tag。阳性克隆通过检测过量表达产物的分子量来确定，对应的分子量应与构建的thioredoxin-VH-linker-VL-B10-V5-6His相一致。图1. A:不同的scFv57P的构建；B:trx-scFvL57P连接到pB

8、AD/Thio-TOPO vector上的方式。 表达单链抗体融合蛋白的TOP10 E.coli 在含有Ampicillin（100 g/ml) 的LB 培养基中培养至OD600 = 0.5，然后用0.01% 的L-arabinose 诱导。在37下用摇床培养4-5 小时后融合蛋白质包涵体含量达到最大，约为总蛋白质的50%左右。尽管thioredoxin 的可溶性很好，但thioredoxinscFv57P融合蛋白质仍以包涵体形式存在。传统离心的方法分离包涵体蛋白质 破碎缓冲液组成：20 mmol/l Tris-HCl, pH 7.5,1mmol/lEDTA, 0.1mM PMSF, DNAs

9、e (10 g/g cell) 细胞破碎缓冲液中不含脲等变性剂，故不溶解包涵体。称取5 g大肠杆菌菌体溶于40 ml 破碎缓冲液中，搅均。用French press 进行破碎操作，至少进行三次循环。破碎后的匀浆在10,000 rpm下离心30 min 后，弃去上清液。离心后的沉淀物质分别用含0.05% Chaps, 0.05% Triton X-100及2 mol/l NaCl 的细胞破碎缓冲液进行悬浮、洗涤并离心。洗完后将沉淀用40 ml的破碎液悬浮，并加入urea 至终浓度为8M，再加入DTE至0.2 mM，室温放置5-6小时后用10,000 rpm下离心30 min弃去沉淀。溶解了的包涵

10、体蛋白质溶液用HCl 调pH 到2-3之间，将样品加入Sephadex G-25 desalting column。在此之前此脱盐柱先用20 mmol/l Tris-HCl，pH2.0，1mmol/lEDTA，8mol./l 脲充分平衡。用凝胶过滤分离包涵体蛋白质 在前面的细胞破碎液内再加入60 g/ml的溶菌酶及0.1%的Trition X-100。3.24 g 的E.coli 用25 ml 的破碎液悬浮。经过French Press破碎后(循环三次)，将破碎液直接加入到1.6*60 cm (120 ml) 的Sepharose HP，这是一种平均粒径为34m的高度交联的agarose 基质

11、胶(通常 是Sepharose 类介质的基质)，它的排阻极限与Sepharose 4B 相似(对球形蛋白质为20 MDa)。柱子用含0.1% Berol 185 的破碎液来平衡。因为它的排阻极限很大，可以让其它蛋白，核酸及其它细胞器等渗入凝胶内部，而只将包涵体蛋白质排阻在外。这样只收集在空体积V0 流出的峰，然后在用8 M urea 和0.2M DTE 完全溶解，还原后在室温下放置5-6 小时。然后再按照前面离心分离的方法，进行酸化后备用。最终溶解的蛋白质浓度为5.7 mg/ml，以此作为后继复性的起始样品液。用稀释法复性包涵体蛋白质 在稀释复性中，对pH, GSH与GSSG的比例与浓度，精氨

12、酸浓度，样品量及复性温度等条件进行了优化。优化后的复性缓冲液组成即做为其它复性方法的基础。最优化的复性液组成为：20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 含0.5 M 精氨酸，1mM EDTA, 1 mM GSH 及1 mM GSSG，这也就是后面常提到的复性缓冲液。25 ml 溶解了的包涵体(5.7 mg/ml 溶在8M urea) 样品稀释200 倍到此复性缓冲液中。金属鳌合层析复性 用5 ml 的Hitrap chelating 柱子，先用Ni 离子饱和，再用含8 M urea 的复性液平衡。然后将100 ml 溶解了包涵体(5.7mg/ml 溶在8 M urea) 的样品加入柱中

13、。用平衡液将基线洗平，然后用200 ml 的线性梯度逐步由含8 M urea 的缓冲液过渡到复性缓冲液中。然后用含0.2 M 的imidazole 将复性后的scFv 洗出柱子。并考察了流速对复性率的影响。透析复性 100 ml 溶解了的包涵体(5.7 mg/ml 溶在8 M urea) 4下在300 ml 复性缓冲液中透析过夜。用脲素及pH 梯度凝胶过滤复性 先将HiLoad 16/60 Superdex 30用一个由上至下线性减少的urea 梯度(8 M 到0.4 M)，同时还存在一个从2-7.5 的pH 梯度平衡上部的60%的柱体积。我们通过先在柱中加入0.4柱体积的pH 7.5 含0.

14、4 M urea的复性缓冲液，随后用0.6 柱体积的线性梯度从pH 7.5 含0.4 M urea 的复性缓冲液变成8M urea pH 2 的溶液中来实现这一点。这样当样品(溶于8M urea, pH 2.0 含5.7 mg/ml 的scFv 融合蛋白质) 加入柱顶后也同样处于与溶解液同样的环境中。因为蛋白质分子很大，并被所选凝胶介质完全排阻在外，因此它向下的速度要比urea等小分子快得多。这样可以通过预先形成的梯度，最后转移到柱子底部的含0.4 M urea 的复性缓冲液中，从而达到逐步脱除变性剂的目的。这个转移的速度由流速来控制，因此我们对流速在一定范围内(0.02到1.0 ml/min

15、) 对复性率的影响进行了研究。同时也考察了样品的量(100 l-1.0 ml) 对复性率的影响。每管收集1.0 ml。 在对照实验中，用无梯度或仅有urea 梯度凝胶过滤复性做为对照。其它条件与脲素及pH 梯度凝胶过滤复性一样。复性率的测量 复性scFv的结合抗原活性是在BIAcore 2000 (Bioacore AB,Uppsala, Sweden) 上用BIA 的测量软件来进行测量。将具有抗原活性的小肽C19V NH2-CRGTGSNRSSFESSSGL VCONH2)通过-SH基团偶联到CM5 蕊片上。标准曲线由纯化的Fab57P 得到。结果与讨论包涵体蛋白质的分离图2. A:E.co

16、li细胞内含有表达的scFv57P融合蛋白质；B:Frenchpress破碎后的匀浆，均用相差显微镜观察得到。图3. 一步凝胶过滤分离纯化scFv57P包涵体蛋白质色谱图，*代表包涵体蛋白质的峰。 一种新的分离方法取代了原来的离心与洗涤过程。通过溶菌酶，DNase，EDTA，非离子形表活剂Trition X-100或Berol185 在French press (APV-Gaulin) 下循环3 到4 次后，可以使细胞的碎片及核酸等其它杂质的尺寸比包涵体蛋白质都 要小(Fig.2)。通过选择合适的大孔凝胶过滤介质，如4%的agarose Sepharose 4 FF or Sepharose

17、HP 的基质。它可以使细胞碎片，多糖，核糖体等杂质从介质中透过，而完全排阻包涵体颗粒。从而，经过层析柱后，可以达到分离纯化包涵体的目的。 在平衡液中加入无紫外吸收的非离子形表活剂Berol 185是为了防止在凝胶过滤过程中膜碎片的聚集和杂蛋白与包涵体非特异性的结合。这样，分离和对包涵体的洗涤可以在一步凝胶过滤中实现。Fig.3是分离过程的层析谱图。表1 是凝胶过滤分离与离心分离的比较。表1. 凝胶过滤与离心分离的比较GelfiltrationDifferential centrifugationInitial quantity of cells (g wet weight)3.245.00Fi

18、nal quantity of scFv inclusion bodyMass (mg)168.15243.75Sample volume (ml)29.512.5Concentration (mg/ml)5.719.5Protein recovery (mg/g cell wet weight)51.948.8Relative recovery106.4%100%a The recovery obtained by differential centrifugation set as 100%.表1. 凝胶过滤与离心分离的比较GelfiltrationDifferential centrif

19、ugationInitial quantity of cells (g wet weight)3.245.00Final quantity of scFv inclusion bodyMass (mg)168.15243.75Sample volume (ml)29.512.5Concentration (mg/ml)5.719.5Protein recovery (mg/g cell wet weight)51.948.8Relative recovery106.4%100%在Vo处出的峰就是包涵体蛋白质的峰，收集后加入Urea和DTE将包涵体蛋白质彻底还原溶解。溶解后的样品就可以不用离心直

20、接应用于后继的复性过程了，但对于标准的分离的过程最后一步的离心通常是需要的。图5. Lanel:图3* 峰，Lane2:通过离心及洗涤得到的scFv57P，Lane3:LMW marker，Lane4:*峰后面的峰，Lane5:Ecoli的总蛋白。不同复性方法的比较不同复性方法的结果的比较见表2。表2. 不同方法复性率的比较Refolding methodRecovery (%)Dilution (稀释复性)14.6Dialysis (透析)0.4IMAC (金属鳌合)14.7Gel filtration (no gradients)14.5(无梯度凝胶过滤)Gel filtration (o

21、nly urea gradient)17.3(脲梯度凝胶过滤)Gel filtration(both pH and urea gradient)25(pH 与脲梯度凝胶过滤)稀释复性稀释复性在蛋白质复性中很常用6,7,8,9。在本实验中，稀释复性用以下条件得到的复性率最高: 蛋白样品稀释200倍后至终浓度为25 mg/ml，在10下过夜。同时，复性缓冲液中含有0.5 M arginine，经过优化后的复性温度是10。透析复性透析复性的复性率在所有方法中最低。因为在此过程中，蛋白质的浓度变化不大，始终保持着较高的浓度，因此在复性的过程中可以很明显的观察到蛋白质的聚集，但在其它方法中，聚集并不是很

22、明显。用(IMAC) 进行复性表3. 流速对IMAC复性的影响Flow rate (ml/min)Recovery (%)0.114.70.513.31.59.42.05.6IMAC 可以用来复性有his-tag 的蛋白质10,11。在IMAC中，可以先将蛋白质通过histine 的作用吸附在介质上。然后，可以通过梯度的设定来逐步脱除urea 等变性剂。因此IMAC 复性可以得到比稀释复性更高的复性率。如表3 所示，低流速下可以得到较高的复性率。这也说明对于scFvfragment 逐步脱除脲比快速稀释的效果要好。脲浓度和pH 联合梯度凝胶过滤复性图4. 尿素与pH 联合梯度凝胶过滤复性scF

23、v57P层析图，点线为A280nm，实线为脲梯度，点线为pH梯度。大孔凝胶过滤介质也曾经被用于蛋白质的复性12, 13, 14。但象本文这样，用较小孔的凝胶过滤介质，通过逐步脱除变性剂的方法还见未报道。我们选用预装的Susssperdex 30进行梯度凝胶过滤复性。将柱子先用脲及pH梯度预平衡后再进行复性的效果最好(Fig.4,表2)。将溶于8 M urea中的scFv融合蛋白加入柱子顶端时，柱子的顶端也是8 M 的urea。而随着层析过程的进行，因为蛋白质的分子量远远大于小分子变性剂，被凝胶介质排阻在外，因此蛋白质的向下的移动速度要远大于各种小分子。这样scFv 融合蛋白就可以通过预先形成的

24、urea 及pH梯度，并最后转移到复性缓冲液中(在柱子出口端占0.4 柱体积)。表4. 流速对IMAC复性的影响Flow rate (ml/min)Recovery (%)0.114.70.513.31.59.42.05.6 通过逐步增加pH及降低urea的浓度，变性蛋白质可以在合适的氧化还原系统中逐步地复性成准确的天然结构。较低的起始pH可以使蛋白质在形成二硫键之前先折叠成一定的类似天然的空间结构，这样可以抑制错配的二硫键。流速也是优化复性过程的一个关键因素。如图4 所示，流速越大，复性率越低。当流速为1 ml/min 或更高时，蛋白质可以在2 小时内流到复性缓冲液中。时间较短，可以看作类似

25、于稀释复性，而在此流速下的复性率也与稀释复性类似(表2，4)。在一定范围内，样品的体积对复性率的影响很小。增加GSSG与GSH并没有使复性率有明显提高，而且在此方法中精氨酸(arginine) 的浓度变化对复性率没有影响， 因为urea本身也可以做为蛋白质复性过程中的聚集抑制剂。 表2 中各种方法的比较说明脲及pH联合梯度对scFv57P 融合蛋白的复性有促进作用。只用脲梯度的复性率与IMAC的复性率相似。新方法促进融合蛋白复性的原因可能是因为将蛋白复性的过程分为两步：先在较低pH下通过逐步脱除脲抑制复性过程的聚集使蛋白质尽可能地折叠成类似天然的结构，然后通过逐步增加pH形成S-S 键。这样在

26、类似天然的结构的基础上可以进一步的抑制错配S-S键(分子内或分子间) 的形成，从而达到进一步促进正确折叠的目的。参考文献1 Rudolph,R.,and Lilie, H.(1996)In vitro folding of inclu-sion body proteins. FASEB J. 10, 49-56.2 Al Moudallal, Z., Briand, J. P., and Van Regenmortel, M. H.V. (1985) A major part of the polypeptide chain of tobacco mosaic virus protein is

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