基因诊断与基因治疗.ppt

1、基因诊断和根治性治疗基因诊断是以脱氧核糖核酸和核糖核酸为诊断材料，通过检查基因的存在、缺陷或异常表达来诊断人类状态和疾病的方法和过程。其基本原理是检测DNA或RNA的结构是否发生变化，DNA或RNA的数量及表达功能是否正常，从而确定受试者在基因水平上是否有异常变化，可作为疾病诊断的依据。(1)基因诊断1。基因诊断的概念和特征。基因诊断的特点：以基因为检查材料和探索对象，属于“病因学诊断”,针对性强。分子杂交技术使用特定的基因序列作为探针，因此具有很高的特异性。由于分子杂交和聚合酶链反应都有扩增作用，诊断灵敏度很高。适用性强，诊断范围广。检测目标可以是内源基因或外源基因。临床意义不仅在于对疾病做

2、出早期准确的诊断，还在于确定个体对疾病的易感性、疾病的分期和类型、监测疗效和判断预后。基因突变类型(1)大片段的缺失、插入和重排。(2)移框突变可以在基因编码序列中删除或插入一个或几个碱基(不是3的整数倍)，这可以改变突变位点后面的三联体读码框，不能编码原始的正常蛋白质，即所谓的移框突变。(3)点突变、密集编码变化、无义突变、错义突变、同义突变；(4)动态突变、三核苷酸重复单元扩增；(3)基因诊断的基本方法(1)核酸分子杂交的Southern印迹法可以检测特定的DNA片段并确定分子量，可用于基因限制性图谱分析、基因突变分析等。Northern印迹可用于组织细胞中总RNA或mRNA的定性和定量分

3、析。原位杂交可以发现染色体中特定基因的位置，检测基因和基因产物的亚细胞位置，可用于染色体疾病的诊断。聚合酶链反应的基本工作原理：通过控制温度，重复进行DNA模板熔化(变性)、引物与模板DNA结合(退火)和DNA聚合酶催化新DNA合成(延伸)，从而使大量的DNA可以连续复制。变性：加热到95左右，使脱氧核糖核酸形成单链模板。退火：当温度降至55或以下时，引物与模板互补形成杂交链。引物决定了聚合酶链反应扩增产物的特异性和长度。延伸：当温度升至70左右时，Taq DNA聚合酶以引物为起点，催化5 3条DNA链的延伸反应，形成新的DNA链。1969年，从美国黄石公园火山温泉的水生嗜热细菌中分离纯化出瑞

4、格聚合酶(Taq酶)，并循环30次。两个引物之间的新DNA片段理论上达到了230个拷贝，大约109个分子。(3)基因多态性的连锁分析基因多态性是指在同一生物体的不同个体的基因组中经常存在的一些基因序列变异，这些变异不影响基因功能。人类基因组每100200个碱基就有一个多态性位点，这是以共显性方式遗传的。遗传非常稳定，可用于连锁分析。连锁意味着一个基因(或一个脱氧核糖核酸序列)和另一个基因在同一条染色体上彼此接近，并且它们同时被遗传。因此，前者可以作为后者的遗传标记。基因多态性是连锁分析中最常用的遗传标记，常用于基因诊断、疾病相关基因定位、亲子鉴定等。第一代多态性标记是RFLP(限制性内切酶片段

5、长度多态性)。第二代多态性标记是短串联重复，即短重复多态性，它是目前最有价值的遗传标记，可以通过聚合酶链反应进行检测。第三代多态性标记是单核苷酸多态性(SNP)，它是指由DNA序列中单核苷酸(碱基)变化引起的多态性，可通过测序聚合酶链反应产物进行检测。限制性内切酶片段长度多态性基因的突变可能导致限制性酶的缺失重复序列(如微卫星DNA、微卫星DNA等)的多态性分析。)已经成为基因诊断的重要基础。如果重复序列两侧的脱氧核糖核酸序列是已知的，可以根据这些序列设计引物，并且可以通过聚合酶链反应产物的电泳分析来检测重复序列的多态性。(2)基因治疗的概念基因治疗是指将某种遗传物质转移到患者细胞中，使其在体

6、内发挥作用，从而达到治疗疾病的目的。1.体细胞基因治疗和生殖细胞基因治疗。基因治疗策略(1)替代基因治疗引入正常基因，通过同源重组原位替代缺陷基因；这个策略很理想，但是很难实现。(2)补偿性基因治疗引入正常基因并表达它们以补偿体内缺陷基因表达不足，目前用于血友病b的体细胞基因治疗。(3)调节性基因治疗引入外源基因以抑制或激活体内基因表达，例如引入肿瘤抑制基因如p53以治疗癌症如肺癌和白血病。(4)人工合成的寡核苷酸可用作反义核酸来抑制模板基因(或翻译模板基因)的转录，或用作核酶来降解基因，或用作siRNA来诱导核糖核酸干扰(RNAi)来降解靶基因。基因转移的方法(1)转染许多方法被用来将外源(

7、靶)基因导入人类细胞。包括脱氧核糖核酸磷酸钙共沉淀、电穿孔、基因枪(脱氧核糖核酸金属粒子轰击细胞)、脂质体法(膜融合法)、受体介导的内吞作用等。(2)显微注射通过显微注射将基因导入人体细胞，适用于生殖细胞的基因治疗。(3)病毒载体使用修饰的逆转录病毒、腺病毒、腺病毒相关病毒、单纯疱疹病毒、痘病毒载体等。作为外源基因载体。逆转录病毒载体是通过修饰莫洛尼鼠白血病病毒(MMuLV)的原始病毒DNA并将其插入质粒而构建的。病毒复制必需的基因(病毒逆转录酶、包膜蛋白和核心蛋白基因)被删除，病毒LTR和病毒包装必需的序列被保留，从而可以插入外源基因和药物筛选基因。这种载体不能在普通细胞中产生病毒颗粒，而只

8、能通过转染特殊包装细胞来产生。4.体细胞基因转移途径(1)离体基因转移回到体内(然后转移到体内)基因转移，这意味着靶基因首先在体外转移到体细胞，然后在筛选和增殖后回到体内。主要步骤是：收集和培养体细胞；将目标基因转移到体细胞(见前面的方法)；筛选和增殖(富集)转基因体细胞；这些体细胞被重新注入自体靶器官。用于基因治疗的体细胞基因转移的组织细胞有：骨髓细胞、淋巴细胞、成纤维细胞、肝细胞、血管内皮细胞、上皮细胞等。(2)体内基因转移体内基因转移是指将目的基因表达载体直接导入人体的方法。皮肤、肌肉、肝脏、血液、肺等。可以用作靶组织。导入目的基因表达载体的主要方式是：将裸DNA溶解后直接注射；脂质体或

9、基因枪法；利用包装细胞生产复制缺陷型重组病毒颗粒。5。基因治疗的应用及前景。目前，在将其作为疾病用于基因治疗研究之前，通常需要满足以下条件。在脱氧核糖核酸水平上，已经证实这种疾病是一种单基因缺陷疾病。仅限于体细胞的基因治疗。基因治疗的靶细胞可以从患者体内获得并培养，然后在基因操作后转移回患者体内。治疗效果必须大于对病人的伤害。表达水平可以改善疾病，没有严格的规定，也没有副作用。必须通过动物实验证明人类基因治疗项目符合严格的安全标准。键入A1问题：答案说明每个问题下面有五个备选答案：A、B、C、D和E。回答问题时，您只能选择最合适的答案，并在答题纸上圈出相应的字母。(1)基因诊断的主要依据是，甲

10、类人类遗传病与基因密切相关，乙类基因有个体差异，丙类大多数人类疾病与基因密切相关，丁类病原体引起人类基因异常，戊类基因可以表达，2)基因诊断特征描述。它可以取代临床生化检测。b具有广泛的诊断范围，内源性和外源性基因都可以检测到。c具有很强的针对性。d具有高灵敏度。e具有很高的特异性。4基因诊断中可用于鉴定的技术是印迹杂交亲和层析。5基因诊断中可用于鉴定的技术是印迹杂交杂交离子交换层析。6用作基因诊断的探针，通常在标记DNA 7PCR技术中某一已知序列标记蛋白质B未知序列RNA C已知功能某一酶D已知序列标记DNA E未知序列。用于限制扩增只在模板DNA的某一部分发生的材料是模板DNA。22 A

11、Taq DNA聚合酶b拓扑异构酶c熔解酶d引物酶EDNA连接酶用于在聚合酶链式反应中扩增DNA。17.用聚合酶链式反应扩增特定的DNA序列的一个重要原因是存在A. DNA聚合酶B .特定的RNA模板C .特定的DNA引物D .特定的RNA引物E4 dNTP，A2型问题：-回答问题时，你只能选择最合适的答案，并在答题纸上圈出相应的字母。目前聚合酶链反应技术中需要一种关键的耐热酶，即逆转录酶、核糖核酸聚合酶、引物酶、聚合酶。主要检测基因组中短串联重复序列b长串联重复序列c染色体末端重复序列d反向重复序列e的回文结构，12路体细胞基因治疗(离体)不包括基因载体的选择、b靶细胞的选择、c基因转移的选择

12、、外源基因表达的筛选、外源基因注入人体组织和器官，反义核酸的主要功能是阻断DNA、阻断RNA、降解DNA、降解RNA和阻断核糖体。b类问题：答案a、b、c、d和e的解释是备选答案。回答问题时，如果这个问题只与答案A有关，请在答题纸上圈出相应的字母A；如果这个问题只与答案B有关，请圈出相应的字母B；等等。您可以选择一个或多个备选答案，也可以根本不选择。反转录聚合酶链反应体外将外源基因导入靶细胞单链构象多态性分析(SSCP)直接注射法18确定基因表达是否异常是优选的19确定限制性位点是否异常。20周期基因治疗(离体)必须通过，bac，基因失活b .基因替换c .基因补充d .限制性内切酶酶谱分析e .聚合酶链式反应(聚合酶链式反应)21使用限制性内切酶和特异性DNA探针检测基因变异的存在22使用特异性引物和反应系统快速扩增试管23中的靶DNA片段，并通过体内正常基因的同源重组原位替换患病细胞中的致病基因，从而将靶基因导入患病细胞而不去除异常基因。请根据问题的意思在答题纸上圈出相应的字母。多项或少项选择不得分。-，基因诊断的基本方法主要基于以下