第3章 蛋白质的通性、纯化和表征.ppt

1、第三章蛋白质的共性、纯化、表征、1，蛋白质的酸碱性质和等电点，蛋白质像多肽一样，可以发生阳性理解，也有等电点。等电点：对于某些蛋白质，在某些pH中正电荷和负电荷完全相同。也就是说，正电荷为零的牙齿pH被称为蛋白质的等电点。在等电点，蛋白质在电场中不运动，溶解度最低，粘度最高。可以用溶解法、集中电泳法等测量等电点。2，蛋白质的胶体性质和蛋白质的沉淀，蛋白质分子直径在1-100nm之间，在水溶液中具有胶体溶液的共性。1.稳定蛋白质胶体溶液的主要因素：蛋白质表面亲水端形成的水合层徐璐分离蛋白质颗粒，凝聚而不徐璐碰撞。良性电解质处于沸腾状态时，带着相同的电荷，徐璐排斥不会发生聚合沉积。胶体溶液中的蛋白

2、质不能通过半透膜，因此可以应用透析法去除非蛋白的小分子杂质。电荷中和或水合层破坏后，蛋白质粒子聚集在溶液中沉淀。2，沉淀蛋白质的方法盐析法：大量中性盐(NH4)2SO4，Na2SO4，NaCl，将蛋白质脱去水合层，收集沉淀。不引起变性。有机溶剂沉积法：破坏水合膜，降低遗传常数、丙酮、乙醇等。重金属盐沉淀法：在pHpI中，蛋白质粒子带有负电荷，重金属离子(Hg2)。Pb2 .Cu2等)和不溶性沉淀形成。生物碱试剂和一些酸类沉淀方法：当pH值小于pI时，蛋白质具有正电荷，容易产生生物碱试剂和酸类负离子和不溶性沉淀。生物碱试剂：单宁酸、硫辛酸、钨酸。酸：三氯乙酸，磺酸盐水杨酸；加热变质沉淀法。3，蛋

3、白质分离纯化的一般原则，纯化的本质：提高产品纯度或比活力更一般的程序：字典处理，粗分级分离，粒度分离，结晶。1，pretreatment:粉碎组织和细胞的动物组织和细胞：传记捣碎机、匀浆机、超声波处理植物组织和细胞：石英砂提取液研磨或纤维素酶处理细菌：超声波振动、沙子和抛光、高压挤压、溶菌酶处理(分解多糖)所需蛋白质提取膜蛋白：用超声波或洗涤剂解膜，然后提取到适当的介质。2、“粗分类分离”(rough fractionation)通常用作可选沉淀法。(NH4)2SO4分级沉积法(盐析)等电点沉淀法有机溶剂分级沉积法，3，粒度分级分离分层分析法：凝胶过滤层，离子交换层，吸附层分析，亲和层分析，疏

4、水层分析纯度越高，溶液越浓，越容易结晶。结晶方法：使溶液稍微过饱和。温度降低，盐析，有机溶剂添加，pH调节。4.蛋白质的分离纯化方法，(1)根据分子大小的差异，透析方法：将样品放入投药袋，半透膜阻止pr分子，去除蛋白质溶液中的中小分子(盐、低分子酸等)。透析和超滤法：不能利用蛋白质通过反渗透膜的性质从样品中去除小分子非蛋白物质。超滤法：施加一定的压力，强迫小分子物质通过半透膜，根据半透膜的筛孔大小切断相应的蛋白质分子。凝胶过滤法(分子筛分层分析法)，凝胶过滤常用的介质：层分析柱内填充有小孔的凝胶颗粒。交联葡聚糖是由葡聚糖和环氧氯丙烷交联形成的三维空间网状结构。聚丙烯凝胶琼脂糖凝胶，凝胶过滤原理

5、，(2)基于溶解度差异的分离方法，蛋白质的盐溶和盐溶：在适当的中性盐浓度溶液中蛋白质的溶解度提高的现象称为盐溶。盐析：在蛋白质溶液中加入大量的中性盐(高盐浓度)会牙齿破坏蛋白质分子表面的水合层(即破坏蛋白质水溶液稳定性的因素)，从而降低蛋白质的溶解度，导致沉淀，称为盐析。用常用的饱和硫酸铵沉淀法分离蛋白质是使用盐析的原理，不同蛋白质对饱和硫酸铵的要求不同，因此可以通过饱和硫酸铵的分级沉淀法分离各种蛋白质。(3)根据电荷性质的差异，1，电泳：有电荷的蛋白质或核酸分子在电场中运动的现象称为电泳。分子量小的蛋白质游泳速度快，分子量大的游泳速度慢，因此蛋白质分离。2 .SDS-聚丙烯酰胺凝胶传记电泳，

6、基本原理：利用聚丙烯酰胺凝胶作为支撑物，根据分离物质携带的电荷量、分子形状和分子大小，在电场的作用下产生不同的迁移速度。聚丙烯凝胶是由单体丙烯酰胺和交叉剂甲基双丙烯酰胺在催化剂和加速器的作用下聚合而成的。网格大小由单体丙烯酰胺和甲阶双丙烯酰胺的浓度和两者的比例决定。将SDS添加到十二烷基磺酸钠(SDS)、聚丙烯酰胺凝胶系统中，SDS用阴离子表面活性剂破坏蛋白质的几乎所有非共价键，从而分解doya蛋白，扩展多肽链，消除蛋白质形状对迁移率的影响。SDS可以将1:2比率和肽链的氨基酸残基结合起来，使跨性别蛋白质具有大量的净负电荷，多肽链中的负电荷量大大超过蛋白质分子的原始电荷量，从而掩盖了蛋白质之间

7、的原始电荷差异，结果所有SDS蛋白复合物从传记神童转移到几乎相同的电荷质量，并具有相同的形态。所以在相同的传记电泳条件下，分子量越大，阻力越大，游泳速度越慢。3，等电点，(1)基本原理根据蛋白质分子的等电点分离。使用牙齿技术分离蛋白质混合物是在具有pH梯度的介质中完成的，在外部电场作用下，各种蛋白质迁移(停留)到与其等电点相同的pH梯度，形成一个狭窄的波段。(2)优点和主要用途没有严格限制位置和体积，分辨率高，可以测量pI，分离速度快，分离的蛋白质保持不变。可用于蛋白质和两性分子的分离分析和蛋白质pI测定。(3)基本操作1，胶粘剂的制造(需要良性电解质)2，加成和传记电泳3，染色和脱色，4，离

8、子交换层分析法，层分析装置渐变混合器，蠕动泵，层分析柱，显示器，记录器，收集器，层分析柱，层分析柱，蛋白质和离子交换剂之间的主要作用：静电引力，(2)基本操作，1，样品准备2，离子交换剂和色谱柱准备选择适当的离子交换剂进行预处理，圆柱床体积是样品体积的2-5倍。3、形状。4.目的蛋白质的溶出方式有逐步提高溶出液的盐浓度(离子强度)，逐步提高溶出液的pH值。5.洗脱液的检测和蛋白质成分回收利用280nm紫外线吸收法监测，(4)亲和层析，亲和层析：利用蛋白质分子特有的识别能力，建立有效的纯化方法。排气：酶的基质、辅酶、抑制剂、效果物及其结构类似物、激素和受体蛋白、抗原、抗体等。亲和层析原理：亲和层

9、析原理，(5)高效液相层分析(HPLC)，HPLC纯化蛋白报告大部分具有实验室规模(数毫克数十毫克)Waters的HPLC大规模准备的层析柱。通过亲和层析的高分辨率和HPLC的快速结合，高效液相层析法的基本概念和分离理论与经典液相色谱法及气相色谱法相一致。高效液相色谱分析系统典型的高效液相色谱分析系统包括输液系统、分层分析器仪和检查系统三个部分。流化床通过高压泵输入。一般可以用微量的注射器直接注入，也可以使用6缸阀门注入。HPLC中使用的探测器使用的紫外线吸收检测(UV)灵敏度最高，最高到ng级别。牙齿外还有荧光探测器、视差光学探测器、电化学探测器等。高效液相色谱的结构图表，5，蛋白质相对分子

10、质量测定，(1)凝胶过滤所使用的介质称为凝胶珠或凝胶颗粒，内部有很多微孔网状结构凝胶颗粒，这些微孔只能进入凝胶粒子内部，而比胶体微孔大的分子在外部洗涤时会阻止大分子与溶液一起先排出，小分子在颗粒网状结构中穿洞蛋白质分子量一般用交联葡聚糖作为凝胶。商品名称：Sephadex需要用几个茄子标准蛋白质的溶出体积Ve相对分子质量对数(logM)对Ve进行图形，得到标准曲线，重新测量未知样品溶出体积。Ve能在标准曲线上找出样品蛋白质的相对分子质量。(b)使用SDS和巯基乙醇(二巯基乙醇)处理SDS页面(12烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶传记电泳)、蛋白质变性(肽链扩展)，与SDS结合形成SDS-蛋白复合物，并

11、使用相对迁移率测定多种标准蛋白相对分子质量的样品相对相对分子质量大的人，移动率小的优点：速度快，样品用量少，可以同时测定几个茄子样品缺点。误差大，约10(误差主要来自移动距离的测量误差)牙齿方法只能测量阿基米德链的相对分子质量。(3)沉淀速度法测定相对分子量，离心，原理：旋转速度越高，移动的物体受到的离心力就越大。当包含悬浮液或聚合物溶液的容器高速水平旋转时，强大的离心力作用于溶剂中的悬浮粒子或聚合物，使其沿着离心力的方向移动，并远离中轴。(威廉莎士比亚，离心力，离心力，离心力，离心力，离心力，离心力)在相同的旋转速度条件下容器内大小不同的悬浮粒子或聚合物溶质以不同的速度下沉。经过一定时间的离

12、心工作，可以实现徐璐其他悬浮粒子或聚合物溶质的有效分离。离心率：低速离心机20006000r/min，高速离心机180025000 r/min，超速种植400080000 r/min，单位离心率沉淀系数一个单位等于10-13秒，斯维德伯格单位或沉降系数单位，即S。，6，蛋白质含量测定和纯度鉴定，总蛋白质含量分析：凯氏氮法、福林-酚试剂法(Lowry法)、紫外线吸收法、布氏法(komas亮蓝法)紫外线吸收法：因为核酸在260nm有光吸收，(a)蛋白质含量测定，Lowry方法：在碱性条件和福林酚富林-二氧化碳含量下，铜离子和蛋白质形成可溶性蓝色配合物，在750 nm具有最大光吸收值。BCA (bicinchoninic acid)方法：最近被广