苯硫脲尝味的群体遗传学调查

1、苯硫脲的群体遗传学考察、1 .实验目的、(1)测定群体中PTC味基因的显性性状和基因型，了解孟德尔基因型与显性性状的对应关系。 (2)了解酶催化剂截断放大器多态性序列(caps ) (也称为PCR RFLP )技术的原理，并使用caps技术检测单核苷酸多态性(SNPs )。 在分子水平上测定PTC味的基因型。 (3)修正集团中PTC味道的基因频率，判断集团是否达到了Hardy-weiberg平衡。 2、实验原理：苯硫脲(phenylthiocarbamide，PTC )是硫脲的苯诱导体(图2.1 )，均为白色结晶粉末，均含硫代酰胺化学基(N-C=S )官能化学基均有苦味。 能够品尝到1/750

2、，0001/50，000 PTC浓度的溶液的味道的人(苦涩，少数人感到甜味)被称为苯硫脲，“品尝到味道的人只能品尝到PTC浓度为1/24，000以上的溶液的味道(对于PTC的结晶物PTC味觉能力是由单基因调控的孟德尔遗传性状，由7号染色体上(7q35-7q36 )的苦味味觉感受器基因TAS2R38确定，其属于常染色体不完全显性遗传。 品味者中的显性基因t的纯合子(TT )可以品尝1750，00016，000，000的PTC溶液的苦味，异质结子(TT )只能品尝1480，000 l380，000的PTC溶液的苦味。 因此，利用对PTC的品味能力可以测定家族中的基因传递和人中的基因频率。 2.2人

3、硫脲味的基因人的PTC味的基因Homo sapiens taste receptor、type 2、member38(TAS2R38)(NM_176817 )、PTC， 也称为T2R38或ttc的大部分味觉者与味觉者的差异为三处单核苷酸多态性(SNPs ) :一处为第145位，味觉者为G145 (查询密码丙氨酸ala )，味觉者为C145 (脯氨酸) 第三位是第886位，味觉者为A886 (查询密码异亮氨酸ile )，味道者为G886 (查询密码缬氨酸val )。 因此，与味觉者的PTC多肽中的3个部位对应的氨基酸分别为ala49、val262和ile262，被称为AVI等位基因，味觉者的3个

4、部位为pro49、ala262和val262，被称为PAV等位基因(图2.2、2.0 ) 在味觉者的PTC查询密码区域中存在5个限制性核酸内切酶Fnu4H1的识别部位(识别序列5-GCNGC-3 )，作为味觉者，第785位的SNP正好形成了多馀的Fnu4H1识别部位(GC )。 因此，利用这种基于SNP的限制性位点多态性，可通过引物扩增包含785位SNP位点的PTC基因查询密码区的一部分，用Fnu4H1截断扩增产物，并切开扩增产物，从而判定某人为单倍型(haplotype ) 3 .实验技术路线，4 .实验步骤4.1说明实验目的、实验原理、实验技术路线的实验方法及注意事项主要仪器设备的使用方法

5、、注意事项(1周前说明，给学生准备时间) (1)说明实验目的、实验原理、实验技术路线。 (2)说明口腔上皮细胞球总DNA的快速提取、基因PCR扩增、DNA阳离子电泳、PCR产物纯化、DNA酶催化剂切割、遗传学分析等实验方法和注意事项。 (3)高压蒸汽灭菌锅、高速离心机、小型瞬时离心机、阳离子电泳修订、水平阳离子电泳槽、涡卷震荡器、磁力搅拌器、电子天平、PCR修订、微波炉、紫外分光光度修订、电磁炉、恒温水族箱、恒温干热会议、凝胶成像装置，制作，4.2 PTC味觉能力的测定4.2.1实验材料4.2.1主要仪器设备高压蒸汽灭菌锅清洁，121高压灭菌20min容量瓶，量筒，烧杯，螺丝口试剂瓶，一次性物

6、品医疗用无菌PE手套，乳胶手套，塑料杯，马克笔。 4.2.1.2试剂和材料(1)材料：受试者是为全体人员完成遗传学大实验的学生。 (2)试剂：苯并硫脲(PTC )结晶、宝贝儿哈哈纯水.4.2.1.3溶液调制(1)原液(1号液) :称量PTC结晶0.65 g，加入宝贝儿哈哈纯水500 ml，室温下将(2)稀释液：原液214倍用宝贝儿哈哈纯水阶段性稀释，制成2-14号(2) 。 对调制的14种浓度的PTC溶液进行过滤灭菌，分别放入灭菌后的100 ml螺丝口试剂瓶中，另外将宝贝儿哈纯水作为第15号液。 4.2.2实验方法(1)使受试者正坐，张开嘴伸舌，用滴管将15号液滴到受试者的舌根部，让受试者慢慢

7、吸口尝味，用纯水进行同样的实验，交替让受试者尝味，避免了受试者的猜测(参照专利文献1 ) (3)如果无法鉴别或无法鉴别，则依次用141号溶液反复试验，直到能够明确鉴别出PTC的苦味。 (4)尝三次，只有三次的结果相同，才是正确的。 (5)记录出品苦味的液体编号和稀释浓度。 4.3人口腔上皮细胞球总DNA的提取4.3.1实验材料4.3.1.1主要器械设备高压蒸汽灭菌锅、磁力搅拌器、电子天平、洁净台、恒温水族箱、涡卷震荡器、高速离心机、恒温振荡床、微量移液器、电炉清洁、121高压灭菌20min量筒、烧杯， 螺丝口试剂瓶、牙签、1.5 mL灭菌微离心管、微量移液器吸引头(枪头)、离心管架、一次性物品

8、医疗用无菌PE手套、口罩、马克笔。 4.3.1.2试剂和材料(1)材料：每组实验选择1名受试者，用灭菌牙刮除口腔上皮细胞球。 (2)试剂：灭菌水、pH参比溶液、细胞球染色体组DNA提取试剂盒4.3.2的实验方法(1)灭菌微量离心管1.5 ml中装入灭菌水100 L。 (2)受试者用无菌牙签轻轻地刮口腔颊的内侧，刮下的细胞球在灭菌水中立即。 (3)涡卷震荡器涡卷振动混练10 s，(4)离心机瞬时离心10 s。 (5)在沸水浴中煮沸5分钟。 (6)离心机13200rpm离心2分钟。 (7)基因组DNA 4C保存准备，4.4 PCR扩增PTC基因片段4.4.1实验材料4.4.1.1主要仪器设备高压蒸

9、汽灭菌锅，高速离心机，小型瞬时离心机，涡震荡器，PCR修订，pH修订，制冰机清洁，121高压灭菌20min的1.5 mL微量离心管，PCR管，微量移液器抽吸4.4.1.2试剂和材料(1)材料：各组受试者口腔上皮细胞球染色体组DNA (2)试剂： Taq DNA多聚酶、dNTPs、灭菌高纯水、Tris盐化学基、Na2EDTA.2H2O PCR引物可委托上海生工生物技术有限公司合成，期望扩增产物303 bp 上游引物： hptcforward5- aactggcagaataagatagatctcaattat-3下游引物： hptcreverse5- aacaaccatcaccctattt-34.4

10、.1 (2) PCR引物工作液： PCR引物(3)TE缓冲液： 10 mmol/ltrishclph8. 0、1 mmol/ledtaph8. 0， 4.4.2的实验方法(1)从制冰机中取出碎冰(0C )，根据从冰箱中取出的(4)碎冰配方和顺序在PCR管中制备PCR缓冲液(为了保持酶活力，保持PCR扩增的专一性和效率，始终在低温下制备)灭菌高纯水31.5 l 10 PCR buffer (为了保持PCR扩增的效率) 5.0l 25 mmm gcl 2.0 l 10 mmdntps 1.0 l 10 mhptcforwardprimer 1.0 l 10 mhptcforwardprimer 1

11、.0 ltaq多聚酶1.0L (建议向多个学生混合以上混合液，然后分注43.5 ul ) 受试者口腔上皮细胞球染色体组DNA 6.5L的总体积50L (5)加盖后，用手指轻轻弹管壁，混入液体，以13200rpm离心10 s (将液体扔到离心管底部)。 (6)在管子上做上标记放入PCR器中(等待其他学生一起开车)。 (94C 94C 55C 72C 72C 4C预改性5 min改性30s退火30s延长30s延长10 min无限40周期(8)PCR产物4C保存应用备份、4.5 PTC基因PCR扩增产物的阳离子电泳检测4.5.1实验材料4.5.1.1主要仪器设备高速离心机、小型瞬时离心机、阳离子电泳

12、、 水平阳离子电泳槽、电子天平、微波炉、凝胶图像拍摄器、制冰机、洁净台、通风架清洁、121高压灭菌20min的微量移液器吸引头(枪头)、离心管信息帧、PCR管信息帧、三角瓶、一次性物品医疗用无菌PE手套、马克笔、保鲜袋、微波炉用手套、三角瓶、搪瓷盘。 4.5.1.2试剂和材料(1)材料：受试者PTC基因PCR产物(2)试剂： Tris盐化学基、冰冰乙酸、Na2EDTA.2H2O、溴化乙锭、阿加德里肌肉、markee 57.1ml冰冰乙酸、37.2g Na2EDTA.2H2O、脱络离子水：取50TAE阳离子电泳缓冲液，脱络离子水稀释50倍(3)0.5mg/ml溴化乙锭(4)溴化乙锭(EB )工作

13、液： 0.5mg/ml EB(1000存积液)，脱络离子水稀释1000倍。 (注： EB为扁平分子，可植入DNA，是一种潜在的诱变剂，接触时携带一次性物品医用无菌PE手套，但并非洪水猛兽，不慎接触皮肤时，皮肤吸收的只是表面，用大量流水冲洗即可。 4.5.2实验方法(1)制备阿加里肌肉凝胶1.2% :称量阿加里肌肉凝胶0.6g，装入三角瓶中，加入50ml 1TAE的阳离子电泳缓冲液，用微波炉加热，不断取出混合，直到烧瓶中的阿加里肌肉凝胶粉完全溶解，将留心50ml倒入刚刚大的橡胶中(2)在桌子上放上糨糊液，在室温下蒸发制冷加热，但不烧手(约50-60C )。 (3)将梳子插入凝胶成型模具的正确位置

14、后，慢慢倒入凝胶溶液。 橡胶溶液注入到与模具的低边缘平坦为止即可。 在桌子上静置10-20分钟，等待糨糊完全凝固。 小心拔出梳子(剩下的凝胶溶液封口后溶化使用)，使凝胶不进入阳离子电泳槽的阳离子电泳液，使凝胶的有样品孔的一侧朝向阳离子电泳槽的负极。 (4)取1片有光纸，加入灭菌水5L、样品缓冲液2L 6，再加入PCR产物5L，制成10L DNA样品。 (5)选择与凝胶相邻的取样孔。 用10l的吸液头分别依次加入5L Marker I进行对照，各组12L PCR产物的阳离子电泳样品(相互比较) (6)根据阳离子电泳槽的长度调整了阳离子电泳校正的电压为120V(10V/cm )、阳离子电泳为203

15、0min。 (请注意正负电极的位置正确连接。) (7)在装有EB的搪瓷器皿中慎重地放入凝胶，染色10分钟后，用自来水浸泡10分钟。 (8)放入凝胶影像学系统中拍摄摄影图片。、4.6 PTC基因PCR产物酶催化剂剪接4.6.1实验材料4.6.1.1主要仪器设备高压蒸汽灭菌锅、高速离心机、小型瞬时离心机、涡旋震荡器、磁力搅拌器、恒温水族箱、恒温干热会议、制冰机、紫外分光光度校正、微量清洁，121高压灭菌20min的1.5 mL灭菌微量离心管， 吸微量移液器头(枪头)、离心管信息帧、一次性物品医疗用无菌PE手套、塑料饭盒、马克笔。 4.6.1.2试剂和材料(1)材料：受试者PTC基因PCR产物(2)试剂：限制性酶催化剂Fnu4H1 4.6.2实验方法(1)2小时前将恒温水族箱或恒温干热校正(或恒温水族箱)从(2)制冰机中取出碎冰(0C )，冰箱中取出必要的试剂(5)采集受试者的PTC基因1L，纯化DNA，用紫外分光光度校正测定其260nm、280nm下的紫外吸光光度值，进行DNA量化分析。 (6)在碎冰上按照处方和步骤在1.5 mL的微离心管中制备酶催化