实验二 血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳.ppt

1、了解血清蛋白冰乙酸细胞里肌肉薄膜阳离子电泳，安徽师范高等院校生科院生化课室，生化实验二、一、实验目的和要求，学习阳离子电泳技术一般原理，冰乙酸细胞里肌肉薄膜阳离子电泳操作技术，测定人血清中各种蛋白的相对含量，二、实验原理。 在一定的pH条件下，由于不同的蛋白质具有不同的等电点而带有不同性质的电荷，因此即使在一定的电场中，它们的移动方向和移动速度也不同，即由于它们的电泳淌度不同而能够分离这些个2 .影响电泳淌度的因素：内在因素：蛋白具有的净电荷的量， 蛋白的大小和形状外部因素：电场强度、溶液的pH值、溶液的离子力和电渗析现象3 .冰乙酸胞里肌肉溶解于有机溶剂(如丙酮、三氯甲烷、氯乙烯、冰乙酸乙酯

2、等)中，该膜具有均匀的泡状结构，厚度约为120 m，具有较强的透射性，分子迁移阻力小。 该薄膜阳离子电泳具有微量、快速、简便、极限分辨率高、样品无拖尾和吸附现象等优点，4 .根据冰乙酸电池里肌肉薄膜阳离子电泳将血中白蛋白以阳离子电泳速度分成5个区，从正极端起依次为白蛋白、1个球蛋白、2个球蛋白、球蛋白及球蛋白三、实验器材1. DYY-6C型双稳时阳离子电泳器和DYY-型阳离子电泳槽均为北京牌市六一仪器厂生产的2 .冰乙酸纤维膜(2 cm8cm) 3.培养皿：一排工作台5定径套通用，平衡， 包括染色在内分别为1个定径套的4 .检查器5 .滤纸6 .载玻片7 .大头针定径套8 .玻片，四，实验试剂

3、，巴氏注音字工具缓冲液(ph 8.6，0.07 mol/l，离子力0.06 )取1.66 g巴氏注音字工具(ar )2.血清蛋白染色(2) 取0.5g氨基布拉克10b，加入蒸馏水40ml，混合甲醇(AR)50ml、冰冰乙酸(AR)10ml溶解，取出后置的试管中储藏的(2)漂白液： 95乙醇(AR)45ml、冰冰乙酸(AR)5ml、蒸馏水50ml，进行混炼五、检测材料、未经溶血的人及动物血清、阳离子电泳器由阳离子电泳池和稳压电源两部分组成，两者之间有专用连接。 稳压电源用于调整电压和通电时间。 阳离子电泳槽和恒压电源接通后，在滤纸桥上铺上点好的醋酯纤维薄膜，盖上盖子通电，调整电压，然后进行阳离子

4、电泳。 注意阳离子电泳槽的电极方向，负极应与醋酯纤维薄膜上的点状原点位于同一侧。 当前，该阳离子电泳装置被改良为数字显示方式的DYY-6C型。 浸渍：将28 cm的醋酯纤维薄膜对着光判别光泽面和无光泽面。 在距无光泽面的短边端1.5 cm处用铅笔轻轻画点样线，将其放入装有缓冲液的平盘中，浸泡30分钟即可点样使用。 点样：用大头针定径套取出浸透的胶卷，夹在两层粗滤纸之间吸收多才缓冲液，然后铺在玻璃板(无光泽面朝上)上。 在另一个载玻片上滴下血清，将点状进样器(玻璃罩的一侧)涂在血清上(可以往复移动)，在点状线上轻轻印刷点状进样器，使血清浸透膜内，形成均匀的直线。操作指南：6，操作步骤，1 .将冰

5、乙酸电池里肌肉膜的润湿和选择冰乙酸电池里肌肉膜在缓冲液中一炷香间浸泡后，每组取出一张冰乙酸纤维素膜，取出时用镊子夹住膜的一端，放入折叠的滤纸上，然后吸走表面液体。 2 .阳离子电泳槽的准备阳离子电泳槽有相互隔离的2个槽，分别放入缓冲液，连接不同的电极，红色为正极，黑色为负极。 各槽有可移动的横棒，滤纸或纱布的一端挂在横棒上，另一端浸在缓冲液中形成滤纸桥。调节两杆之间的距离，使其略小于醋酯纤维胶片的长度，将好的醋酯纤维胶片架在滤纸桥上。 点样：先将毛细血管插入血清，封闭上端，均匀涂抹在载玻片一端，使样品连续、均匀、适量，将载玻片轻轻平稳地印刷在薄膜毛面上。 点样本区域距阴极端子1.5cm (参照

6、图)。 这一步是实验的关键。 (4)阳离子电泳将点端的薄膜平坦地粘贴在阴极阳离子电泳槽支架的滤纸桥上(点面朝下)，另一端平坦地粘贴在阳极端子支架上(参照下图)。 胶卷贴紧滤纸桥，贴在直溜溜上，要求中间不要下垂。 连接阳离子电泳装置。 在室温下阳离子电泳，打开电源开关，调节电流强度0.3mA/cm的膜宽(24张薄膜为14.4mA )。 通电5min后，调节电流强度0.5mA/cm的膜宽(24张薄膜为24mA )、阳离子电泳时间50min。 阳离子电泳后，调节旋钮使电流为零，关闭阳离子电泳器，切断电源。 5 .染色：阳离子电泳结束后取出薄膜，在含有氨基布拉克10B染色液的培养皿中浸渍5分钟6 .冲

7、洗：将薄膜从染色液中取出后，转移到冲洗液中冲洗数次，冲洗到背景变蓝，带子清晰后，可以看到彩色带清晰的电泳动态视频图像7 .记录分析实验结果的冲洗结束后取出薄膜，放置在滤纸上。 根据胶片颜色的浓淡、形状、大小以及相对位置记述胶片上的5条色带，记录在预习簿上，对其结果进行判断分析。 整理桌上的机器和试剂，清洁自己的操作台，请老师检查，实验报告当场交给老师。 七、注意事项一、薄膜浸润和选择膜是阳离子电泳成败的关键之一。 2 .样品时，用滤纸吸取薄膜表面雄辩的缓冲液，吸水量最好不要湿。 3 .样品的情况下，动作要轻、稳定，用力过度，不能损伤胶片，印刷凹陷，影响阳离子电泳区域的带分离效果。 4、点样本应该在薄膜毛面上，点样本的量应该适量，有时太多有时太少有时使不得。 5 .阳离子电泳时将薄膜的点状端置于阳离子电泳槽的负极端，使点状面朝下。 6 .特罗尔整染色时间。 时间长，薄膜的底色难以脱落的时间过短，着色难以分辨，或者引起乐队的染色不均匀，可以根据需要进行再