课题2　土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

1、课题2：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数,尿素颗粒,尿素分子的立体结构,尿素CO(NH2)2重要的农业氮肥 尿素不能直接被农作物吸收，只能被土壤中细菌分解为NH3 才能被植物吸收利用。土壤中的细菌分解尿素是因为它们能 合成脲酶。 CO(NH2)2 + H2O CO2 +2NH3,脲酶,一、研究思路,（一）筛选菌株 例：PCR（多聚酶链式：反应体外将少量DNA大量复制的技术） 需耐高温的DNA聚合酶，科学家从耐热菌Taq中分理得到耐高温的TaqDNA聚合酶。而Taq细菌是从热泉中发现的。,根据目的菌株对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。,为什么Taq细菌能从泉中被筛选出来呢？,自然界中目的菌

2、株筛选的依据：,热泉70-80的高温条件淘汰了绝大多数微生物，而使耐热的Taq细菌脱颖而出。,【选择培养基】,允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止 其他种类微生物生长的培养基。,实验室中微生物的筛选原理： 人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。,具有。以尿素为唯一氮源的培养基可以分离到产生脲酶的微生物,【分析培养基】,下面是本课题将用到的培养基配方，请根据下表回答下面的问题。 将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1000 mL (1)在该培养基的配方中，为微生物提供碳源的是_，提供氮源的是_。 (2)绝大多数微生物都能利用_，但是，只有能合成

3、脲酶的微生物才能分解_。 (3)分析该培养基的配方，该培养基对微生物是否具有选择作用？如果具有，又是如何进行选择的？ _。,（二）统计菌落数目 1活体计数法（稀释涂布平板法） （1）操作方法： 稀释涂布平板统计菌落数 （2）原理： 在稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。 通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。即1个菌落1个活菌。,（3）【统计原则】： 选 30300个菌落的平板统计； 每个稀释度取3个平板，取其平均值； （4）【结果】统计的菌落往往比活菌的实际数目低。这是因为两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。因此，统计

4、结果一般用菌落数而不是活菌数来表示。 2显微镜直接计数法：这种方法是利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。缺点是不能区分死菌和活菌。,两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果： A同学涂布了一个平板，统计的菌落数为230； B同学涂布了三个平板，统计的菌落数分别为21、212和256，该同学以这三个平板上菌落数的平均值163作为统计结果。 你认为哪位同学的结果更接近真实值？你认为这两位同学的实验需要改进吗？如果需要，如何改进？,第一位同学没有设置重复组，因此结果不具有说服力。 第二位同学考

5、虑到设置重复实验组的问题，但其中一个平板的计数结果与另外2个相差太远，说明在操作过程中出现了错误，因此不能简单地将3个平板的计数值，来求平均值,【三、设置对照】 1设置对照的目的： 排除实验组中非测试因素对实验结果的影响， 提高实验结果的可信度。 2对照实验： 是指除了被测试的条件外，其他条件都相同的实验。 满足该条件的称为对照组，未满足该条件的称为实验组。 启示：在设计实验时，一定要涂布至少3个平板，作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性。,在做“土壤中分解尿素的细菌的分离和计数”实验中，小张同学在没有设置对照的情况下，从对应倍稀释的培养基中筛选出大约150个菌落。但是，其他同学在同样的稀

6、释度下只筛选出大约50个菌落。 经过大家的讨论，认为小张同学和其他同学的实验结果不同的主要原因可能有：培养基被杂菌污染了；培养基中混入了除尿素以外含氮物质，导致不能分解尿素的细菌也能在该培养基上生长；所选用的土壤样品不同。 你能通过设置对照，帮助小张同学排除上述两个可能影响实验结果的因素吗？,原因分析：培养基污染或操作失误 方案一：其他同学用与小张同学一样的土样进行实验，结果与小张同学一致，则证明小张无误；结果不同，则证明小张同学的操作或培养基的配置有问题。 方案二：将小张同学制备的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否收到污染,二、实验设计,（一）土壤取样 1取样的

7、位置： 土壤含有大量的微生物，其中70 90是细菌，是微生物的天然培养基。细菌适宜在酸碱度接近中性的潮湿土壤中生长，在富含有机质土壤层的38cm处中分布着绝大多数的细菌。 2取样要求：先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。 （二）制备培养基 制备以尿素为唯一氮源的选择培养基。,（三）样品稀释与取样涂布 原则：确保菌落数在30300之间。 接种：用适当的稀释液涂布平板。 1测细菌数： 一般用104、105、106稀释液 2测放线菌： 一般用103、104、105稀释液 3测真菌数： 一般用102、103、104 稀释液,当第一次做这个实验的时候，可以将稀释的范围放宽一点。

8、 如：可以将103-107倍的稀释液分别涂布到平板上培养，以保证能从中选择出菌落数在30-300间的平板进行计数。,（四）微生物的培养与观察 1培养： 细菌：3037，12 d； 放线菌： 2528， 57 d ； 霉菌：2528， 34 d。 2观察：每24h统计一次菌落数目；以“稳定菌落”为观察对象。 （五）鉴定 鉴定分解尿素的细菌原理：P26 脲酶催化尿素分解成氨培养基碱性增强 酚红变红脲酶阳性,菌落的形状、大小、隆起程度和颜色,（一）无菌操作 1取土样的用具在使用前都需要灭菌。 2应在火焰旁称取土壤，并在火焰附近将土样倒入烧瓶中，塞好棉塞。 3在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。 （二）做好标记 本实验使用的平板和试管比较多，为避免混淆，使用前要做好标记。 （三）制定计划 对于耗时较长的生物实验，要事先规划时间，以便提高工作效率，在操作时更加有条不紊。,三、操作提示,四、结果分析与评价,1、对照的培养皿在培养过程中没有菌落的生长，说明培养基没有被杂菌污染， 牛肉膏蛋白胨培养基的菌落数目明显大于选择培养基的数目，说明选择培养基已经筛选出一些菌落。,2、如果得到2个或2个以上菌落数目在30-300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能进行菌落的计数,1.在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果PH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素