课题2　土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 (10)

1、课题2 土壤中分解尿素的细菌的 分离与计数,尿素CO(NH2)2重要的农业氮肥。 只能被土壤中细菌分解为NH3才能被植物吸收利用 CO(NH2)2 + H2O CO2 +2NH3,分离产生脲酶的细菌,一、课题背景,二、研究思路,（一）筛选菌株 提出的问题 如何寻找耐高温的酶？ 解决问题的思路 寻找耐高温环境； 原理 高温淘汰其他菌，选出耐高温细菌， 耐高温菌种提取耐高温酶。,（一）筛选菌株KH2PO4 1.4g NaHPO4 2.1g MgSO4 H2O 0.2g 葡萄糖 10.0g 尿素 1.0g 琼脂 15.0g 将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1000mL。,该培养基的配方中，为微生物的

2、生长提供碳源和氮源的分别是什么物质？ 此配方能否筛选出产生脲酶的细菌？为什么？,?,碳源：葡萄糖、尿素,氮源：尿素,能。只有产生脲酶的 细菌能利用尿素作为氮源而生存。,（一）筛选菌株1、选择培养基： 允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。 2、菌株： 纯且活状态所保存的菌种 。,（二）统计菌落数目： 1、活体计数法（稀释涂布平板） （1）操作方法： 稀释涂布平板统计菌落数 （2）原理： 1个菌落1个活菌 （3）统计原则 选 30300 个菌落的平板统计 每个稀释度取3个平板取其平均值,例：两位同学用稀释涂布平板法测定同 一土壤样品中的细菌数。从对应稀释倍数为 10

3、6的培养基中，得到以下两种统计结果。 1、甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230。 2、乙同学在该浓度下涂布了A、B、C三个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，该同学以这三个平板上菌落数的平均值163作为统计结果。 你认为这两位同学的作法正确吗？如果有问题，错在哪？,甲：没有重复实验（至少涂布3个平板） 乙：A组结果误差过大，不应用于计算平均值,?,（二）统计菌落数目 1、活菌计数法 （4）统计结果：统计的菌落数往往比活菌的实际数目低，因此统计结果一般用菌落数表示。 每克样品中的菌株数=（C/V)* M C:某一稀释度下平板上生长的平均菌落数； V:所用稀释液的体积；M

4、:稀释倍数。,为什么？,2、显微镜直接计数,利用选择培养基进行尿素分解菌的分离过程中，从对应稀释倍数为106的培养基中，A、B两同学分别得到以下两种统计结果。 1、A同学筛选出150个菌落。 2、B同学筛选出50个菌落。 B认为A的培养基被杂菌污染了，或培养基中混入了其他含氮物质，因而导致不能分解尿素的细菌也能在该培养基中生长。A确认自己的操作无误，但也拿不出能令人信服的证据。 请你帮助A同学改进实验，提供具有说明了的证据。,设置对照同等条件下，培养空白培养基,?,（三）设置对照 1、设置对照的目的： 排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。 对照实验是指除了 被测试 的

5、条件外，其他条件都 相同 的实验。,四、实验过程,（一）土壤取样 1、天然培养基和合成培养基： 2、土壤取样： （1）取样的位置： 土壤，天然培养基，含有大量的微生物，其中7090是细菌。在富含有机质的土壤层的38cm处中分布着绝大多数的细菌。 （2）取样要求：铲去表层土。,（二）样品稀释 （1）测细菌数：一般用104、105、106稀释液 （2）测放线菌：一般用103、104、105稀释液 （3）测真菌数：一般用102、103、104稀释液 原则：确保平板上的菌落数在30300之间。 （三）微生物的培养与观察 1、接种：用适当的稀释液作涂布平板 2、培养：细菌：3037，12d; 放线菌:2528, 57d; 霉菌: 2528, 34d. 3、观察：a.每24h统计一次菌落数目 b.以“稳定菌落”为观察对象,（四）鉴定：筛选后必鉴定 鉴别培养基：不影响微生物的生存 酚红培养基： 鉴定分解尿素的细菌。 原理：脲酶催化尿素分解成氨培养基碱性增强 酚红变红脲酶阳性,(1)作样品系列稀释液 (2)用适当的稀释液涂布