13细胞衰老与凋亡

1、,Chapter 13 细胞衰老senescence和凋亡（apoptosis）,衰老的细胞具有哪些特点？,衰老的原因是什么？ 1.自由基学说。 2.端粒学说。,什么叫细胞的凋亡？为什么也称为细胞编程性死亡？ 细胞凋亡的意义是什么？,1.完成正常发育。 2.维持内部环境的稳定。 3.抵御外界各种因素的干扰。,细胞坏死与细胞凋亡有什么不同？,第一节 细胞的衰老 一、早期的细胞衰老研究 100年前魏斯曼的种质不死学说 原生动物细胞 34年的鸡心细胞的否定 小鼠L系细胞 HeLa肿瘤细胞,Hayflick limitation 1961年，Hayflick 首次报道了体外培养的人成纤维细胞(huma

2、n fibroblast)具有增殖分裂的极限。他利用来自胚胎和成体的成纤维细胞进行体外培养，发现胚胎的成纤维细胞分裂传代50次后开始衰退和死亡，而来自成年组织的成纤维细胞只能培养1530代就开始死亡。 。,二、Hayflick界限,体外培养人的成纤维细胞，在体外分裂次数有限，证明细胞不是不死的 将老年的人的成纤维细胞与年轻的人的成纤维细胞同时培养，年轻状态的细胞在体外分裂次数更多，说明衰老与供体细胞的年纪有关 老年的人的成纤维细胞与年轻的人的成纤维细胞进行混合和单独培养比较实验，发现二者的分裂次数没有变化，说明与培养的环境无关 利用细胞杂交的方法确定引起衰老的真正原因。年轻的胞质体与年老的完整

3、细胞融合，杂种细胞不能分裂；年老的胞质体与年轻的完整细胞融合，杂种细胞分裂能力与年轻相同，证明细胞核是导致衰老的真正原因,Hayflick的一些经典实验,体外培养成纤维细胞 来自胎儿 可传代 50 次 （与供体年龄 来自成人 可传代 20 次 有关） 来自小鼠 可传代 1428 次 （与供体物种 来自乌龟 可传代 90125 次 特性有关）,体外培养的人和动物细胞的寿命与他们个体寿命的关系 物种 成纤维细胞传代数 个体最长寿命（年） 龟 90125 175（？） 水貂 3034 10 鸡 1535 30 小鼠 1428 3.5 人 胚胎 4060 110 出生至15岁 2040 15岁以上 1

4、030 早老病患者 210 1020,Human fibroblast cultured in vitro,YONG,OLD,早衰症是人体衰老中的一种病症,3 早老症病人细胞培养只传代2-4次,4 用巴氏小体做标记 老男和少女细胞的培养 证明细胞内部决定衰老 5 胞质体和完整细胞的融合实验 证明是细胞核决定衰老 Hayflick得出这样的结论 细胞、至少是培养的细胞，不是不死的而是有一定寿命的。它们的增殖能力不是无限的，而是有一定界限的。这就是有名的Hayflick界限。,三、细胞在体内条件下的衰老 人体和动物的各种器官和组织都是由细胞组成的，整体水平的老化是机体各部分组织细胞老化的总的反映。

5、从五官的感觉功能的老年性退化，如人眼的视力调节能力随年龄而降低，到老年性疾病引起死亡率的提高，如肾、心、脑组织中血管的故障、骨质疏松、肺功能和免疫功能的缺陷等等，都是以细胞发生的变化为基础的。,不同种类的细胞寿命相差很大。高等动物体内存在了3种不同类型的细胞，第1类细胞的寿命接近于动物的整体寿命，如神经元和肌肉细胞等。在胚胎发育终了时，这些细胞不再增加数量，在个体的生长期中它们可增长细胞体积，以使其与躯体成比例。它们随着个体衰老而衰老，或者由于这些细胞的衰老、死亡引起个体死亡。,第2类是缓慢更新的细胞，它们的寿命短于动物的平均寿命，如肝细胞，胃壁细胞等。 第3类是短命的、快速更新的细胞，如皮肤

6、的表皮细胞、红细胞和白细胞等。因此，机体可以不断有大量的细胞衰亡，如皮肤的表皮细胞死亡，形成角质化的保护层，保护着内层的细胞，但这并不影响其生存。只有当与个体生命休戚相关的神经，心肌细胞大量衰亡时才会造成整体的死亡。,四、衰老细胞结构的变化 （一）衰老过程中细胞核的变化 在衰老变化中细胞核结构的最明显变化是核膜内折Nuclear invagination 。电镜检测可见衰老细胞核形状不规则、内陷和断裂。在体内细胞中也观察到核膜的不同程度的内折，神经细胞尤为明显，这种内折随年龄增长而增加，最后可能导致核膜崩解。 染色体固缩化是衰老细胞核中另一个重要变化。在衰老细胞中，细胞核固缩，还常常出现核内容

7、物，核质染色加深，核的细致结构逐渐消失， 核仁裂解为核小体。,（二）内质网的变化 ER degradation 在衰老细胞中，内质网排列变得无序，膜腔膨胀扩大甚至崩解，膜面上核糖体数量减少。 （三）衰老过程中线粒体的变化 Number of mitochondria decrease and volume increase 多数研究工作表明，细胞中线粒体的数量随着年龄的增大而减少，而其体积则随着年龄的增长而增大。衰老的神经元，肝脏细胞和肌细胞的线粒体数目减少，但体积增大。同时，线粒体的结构也发生变化，肿胀空泡化，内部嵴大大减少。线粒体崩解是细胞衰老变化的重要标志。,（四） 致密体的生成 Den

8、se bodies formation 也称脂褐质、老年色素、血褐质、脂色素等 （五）膜体系的变化 膜相由液晶相转向凝胶相，由柔韧转向刚性； 细胞的间隙连接明显减少，组成间隙连接的膜内颗粒聚集体变小，这种变化使细胞间代谢协作减少了。 细胞膜上的微绒毛数目增加，补偿了衰老时细胞间联系的衰退，以利于保持内环境的稳定。,五、细胞衰老的分子机制 （一）自由基学说 自由基：那些带有奇数电子数的化学物质，即它们都带有未配对的自由电子，这些自由电子导致了这些物质的高反应活性。 生物氧化、辐射、受污染物的侵害以及细胞内的酶促反应 ROS：O2OH H2O2， 级联反应,RO2ROO ROORHROOHR RR

9、R：R 抗氧化酶和抗氧化物质: 超氧化物歧化酶（SOD），过氧化氢酶（CAT）以及谷胱甘肽过氧化物酶（GHSPX）。Ve和Vc是小分子抗氧化物质。,过多的自由基对许多细胞造成损伤: 不饱和脂肪酸,蛋白质,糖类化合物,DNA 自由基氧化体内存在的不饱和脂肪酸，使脂肪变性形成过氧化脂质并分解为醛类，再和磷脂蛋白质结合成脂褐素，因脂褐素在细胞内大量沉积，破坏细胞亚显微结构而使细胞萎缩和衰亡。,（二）线粒体自由基假说 线粒体DNA易受到自由基的损伤，这是因为线粒体DNA处于自由基产生的邻近部位，故易被氧化攻击。此外线粒体DNA不像核DNA那样被包围着的蛋白质保护。,（三）染色体端粒(telomere)

10、和衰老 Telomere and cellular aging( mitosis clock) 端粒是由简单的富含T和G的DNA片段的重复序列组成。人类端粒结构为染色体末端重复上千次的TTAGGG序列所组成。DNA聚合酶不能完成线性染色体末端DNA的复制，真核细胞染色体末端的端粒随着细胞分裂而缩短。染色体末端端粒随着每次细胞分裂逐渐缩短，直到不能分裂走向衰老。 人类生殖细胞一生中维持分裂。不断增殖的原因是该细胞表达端粒酶。端粒酶telomerase以自身一段RNA为模板，通过逆转录酶，转录出一段端粒片段并使之连接于染色体的端粒末端，使端粒不缩短，维持完整，从而保持了细胞的永生化生长。 在人类正

11、常组织的体细胞均无端粒酶活性。 在绝大多数恶性肿瘤细胞中显示明显的端粒酶活性，这可能是肿瘤细胞具有永生性生长的原因之一,2.Apoptosis, Programmed cell death,Biological functions of apoptosis,细胞凋亡是多细胞生物在发育过程中，一种由基因控制的主动的细胞生理性自杀行为 ，是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程。,死亡意味着生命的终止是生物界普遍的现象。细胞的死亡有两种不同形式：一种是坏死（性）或意外（性）死亡（necrosis），它是由某些外界因素比如局部贫血，高热以及物理、化学损伤和生物侵袭等造成细胞急速死亡，是一种被动

12、性死亡。,2002年诺贝尔生理学或医学奖 英国科学家悉尼布伦纳（SydneyBrenner） 英国科学家约翰苏尔斯顿（JohnE.Sulston） 美国科学家罗伯特霍维茨（H.RobertHorvitz）,2002年的诺贝尔生理学和医学奖授予了在器官发育和程序性细胞死亡研究领域中做出奠基性贡献的3位科学家: 英国的Brenner、Sulston和美国的Horvitz 他们创造性地用线虫作为实验模型,实现了对器官发育过程中细胞分裂、分化的原位观察,完成了细胞图谱的绘制, 在此基础上发现并研究了调控器官发育程序性细胞死亡的关键基因及其功能并进一步在高等哺乳动物中发现了相关功能基因。,Morphol

13、ogical and biochemical characteristics of apoptosis, Morphologi changes: Early : Chromosome condensation, cell body shrink Later : Blebbing and Nucleus and cytoplasm fragment Apoptotic bodies At last: Phagocytosed,1.细胞凋亡的起始,染色质固缩、分离并沿核膜分布 2.凋亡中的细胞,细胞膜反折,包围细胞碎片,如染色质片段和细胞器,出芽形成凋亡小体 3. 凋亡小体被邻近细胞吞噬,A、No

14、rmal cell,B、Apoptosis: Apoptotic bodies, Biochemical characteristics of apoptosis :,Apoptosis induced by Cyto C Lane 10 h 21 h 32 h 43 h 54 h 6Control 7Marker,2.0kbp,1.0,0.5,0.2,180200bp DNA ladder, Accumulation of转谷氨酰胺酶 tTG, PS flip-flop,Contrast ofApoptosis and necrosis,Apoptosis,Necrosis,Death by

15、 apoptosis is a neat, orderly process,3.Molecular mechanisms of apoptosis,细胞凋亡的途径主要有两条，一条是通过胞外信号激活细胞内的凋亡酶caspase、一条是通过线粒体释放凋亡酶激活因子激活caspase。这些活化的caspase可将细胞内的重要蛋白降解，引起细胞凋亡。 ICE(白介素-1-转换酶)、Apaf-1(凋亡酶激活因子-1)、Bcl-2、Fas/APO-1、c-myc、p53、ATM等。,Apoptosis is carried out by a proteolytic system caspase,(1) W

16、hy called caspase?,Active site: Cysteine Cleavage site: Asparatic acid,Cysteine Asparatic acid specific protease,Aps-Xxx,天冬氨酸特异性的半光氨酸蛋白水解酶,秀丽隐杆线虫 (Caenorbabditis Elegans) 1031个细胞 ，131个细胞凋亡 找到一系列与细胞凋亡有关的基因 ced-3、ced-4 诱发、启动凋亡 ced-9 抑制凋亡 ced-3、ced-4 基因突变或缺失，使凋亡受阻 移入 ced-9 使凋亡受阻 失去 ced-9 使细胞凋亡,Apoptosi

17、s can be divided into two phases：,Activation phase： The cell responds to “death signals” that commit it to undergoing self-destruction. Execution phase： The death sentence is carried out. Apoptosis cells are recognized by phagocytes because they carry exposed markers, called “eat me” signals. The be

18、st studied “eat me” signal is the presence of phosphatidylserine molecules in the outer leaflet of PM of apoptotic cells (by flop-flipase).,How to activate caspases?,Procaspase,NH2-terminal prodomain: Highly variable,Large subunit (20kD),Small subunit (10kD),Procaspases are activated by binding to a

19、daptor proteins,起始者活化执行者 Caspase2 Caspase3 Caspase8 Caspase6 Caspase9 caspase7 Caspase10,（一）caspase(ICE蛋白酶家族)家族与凋亡 1 caspase家族 ICE基因 哺乳动物中克隆出的与线虫细胞凋亡基因ced-3的同源基因。 ICE是一个半胱氨酸蛋白酶。 ICE基因定位于人类染色体11q23，其cDNA全长1.35kb，编码由404个氨基酸残基组成的45kd蛋白。迄今已发现了11个同源基因，1996年后这些家族成员统称为Caspase，它能选择性地切割蛋白质使其失活或激活。 Caspase是一组

20、在细胞质中结构相关的半光氨酸蛋白酶。 同样它能切割蛋白使其或激活或失活。 表13-1（教材460）列出了caspase家族成员及其底物,caspase家族成员基本功能 Caspase1 Caspase11 不直接参与细胞凋亡信号的传导 Caspase4 Caspase2 Caspase8 参与细胞凋亡的起始 Caspase9 Caspase10 Caspase3 Caspase6 参与细胞凋亡的执行 caspase7,FasL/Fas,FADD,TRADD,DISC,死亡诱导信号复合物,Apaf-1 (apoptotic protease activating factor-1)， Apaf-

21、1具有激活Caspase3 (CPP32)的作用,细胞色素c(Apaf-2),（三）bcl2家族 细胞凋亡抑制基因，名称来源于B细胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma/Leukemia-2，bcl-2)，最早由Tsujimoto（1985）从伴有14、18染色体易位的淋巴瘤细胞中发现，在正常人体内位于18号染色体，在患者易位于14号染色体,bcl-2基因是抑制细胞程序性死亡的基因，它定位于人的第18号染色体，从人的滤泡性B细胞瘤中分离出的bcl-2基因产物与Ced-9蛋白的氨基酸序列有23的同源性，都可抑制多种原因诱导的细胞凋亡，说明两者都属于抗凋亡基因。,Bcl-2是一个不断

22、扩增的多基因家族的原型（prototypes），其在哺乳类中的家族成员有Bcl-x,Mcl-1,Bax,Bak,Bad,A1和Bik-1。大量实验证明它是多细胞动物中普遍存在的“长寿”基因，如神经元寿命长，bcl-2的表达则高于其他类型细胞。,Bcl-2蛋白家族成员概况 家族成员与 Bcl-2同源性 Bcl-2 抑制凋亡 Bcl-xl 44 抑制凋亡 Bcl-x 促进凋亡 Bax 21 促进凋亡 Bak 28 促进凋亡 Bad 促进凋亡 A1 40 抑制凋亡 Mcl-1 35 抑制凋亡,（四）p53 p53是肿瘤抑制基因，可以阻断细胞周期和诱导细胞凋亡。长期以来人们认识到细胞在DNA损伤后便停

23、止DNA复制，这是P53蛋白表达、聚集并进一步上调一系列基因表达的结果。 P21便是其中之一, P21具有抑制细胞周期素/细胞周期素依赖性激酶的底物磷酸化作用，导致G1期阻滞，使细胞赢得时间，在进入S期前修复损伤的DNA。,如果损伤不能修复，P53就激活那些诱导细胞凋亡的基因转录，使细胞进入凋亡状态。当P53基因发生缺失或异常时，P53失去对细胞的监视作用，带着损伤的DNA进入S期，其结果是细胞因遗传不稳定性而产生突变和染色体畸变，最后导致细胞癌变。 ，P53基因产物诱导细胞凋亡，可提供一种防护机制，使DNA损伤的细胞不能存活，而走向程序性死亡。,（五）细胞凋亡的信号传导 1 Ras-p13-

24、K-Akt(PKB)抗细胞凋亡途径 Akt又叫PKB可以特异的使酶原Caspase9的大亚基196位丝氨酸磷酸化。因而Caspase9不能参与Caspase3的活化。从而起到抗细胞凋亡的作用。,2 NF-kB与细胞凋亡 NF-kB是细胞核内的基因转录的调控因子 它的靶基因是TRAF，IAPS等，这些基因的表达蛋白能抑制Caspase8的活性从而抑制细胞凋亡。 Ras活化NF-Kb， NF-kB通过调控靶基因表达蛋白，抑制Caspase8的活性，从而抑制细胞凋亡。,Caspase8,Akt又叫PKB可以特异的使酶原Caspase9的大亚基196位丝氨酸磷酸化。因而Caspase9不能参与Casp

25、ase3的活化。从而起到抗细胞凋亡的作用。,这些基因的表达蛋白能抑制Caspase8的活性从而抑制细胞凋亡。,抑制,。,Ras活化NF-Kb， NF-kB通过调控靶基因表达蛋白，抑制Caspase8的活性，从而抑制细胞凋亡,Textbook-free classroom,The 2002 Nobel Prize in Physiology or Medicine 7 October 2002 The Nobel Assembly at Karolinska Institutet has today decided to award The Nobel Prize in Physiology o

26、r Medicine for 2002jointly to,Sydney Brenner, H. Robert Horvitz and John E. Sulston for their discoveries concerning genetic regulation of organ development and programmed cell death,Sydney Brenner,H. Robert Horvitz,John E. Sulston,It is of considerable biological and medical importance to understan

27、d how these complicated processes are controlled. In unicellular model organisms, e.g. bacteria and yeast, organ development and the interplay between different cells cannot be studied. Mammals, on the other hand, are too complex for these basic studies, as they are composed of an enormous number of

28、 cells. The nematode C. elegans, being multi-cellular, yet relatively simple, was therefore chosen as,the most appropriate model system, which has then led to characterization of these processes also in humans. Programmed cell death,Normal life requires cell division to generate new cells but also t

29、he presence of cell death, so that a balance is maintained in our organs. In an adult human being, more than a thousand billion cells are created every day. At the same time, an equal number of cells die through a controlled suicide process, referred to as programmed cell death.,Developmental biolog

30、ists first described programmed cell death. They noted that cell death was,necessary for embryonic development, for example when tadpoles undergo metamorphosis to become adult frogs. In the human foetus, the interdigital mesoderm initially formed between fingers and toes is removed by programmed cel

31、l death. The vast excess of neuronal cells present during the early stages of brain development is also eliminated by the same mechanism.,The seminal breakthrough in our understanding of programmed cell death was made by this years Nobel Laureates. They discovered that specific genes control the cel

32、lular death program in the nematode C. elegans. Detailed studies in this simple model organism demonstrated that 131 of totally 1090 cells die reproducibly during development, and that this natural cell death is controlled by a unique set of genes.,The model organism C. elegans Sydney Brenner realiz

33、ed, in the early 1960s, that fundamental questions regarding cell differentiation and organ development were hard to tackle in higher animals. Therefore, a genetically amenable and,multicellular model organism simpler than mammals, was required. The ideal solution proved to be the nematode Caenorhab

34、ditis elegans. This worm, approximately 1 mm long, has a short generation time and is transparent, which made it possible to follow cell division directly under the microscope.,Brenner provided the basis in a publication from 1974, in which he broke new ground by demonstrating that specific gene mut

35、ations could be induced in the genome of C. elegans by the chemical compound EMS (ethyl methane sulphonate). Different mutations could be linked to specific genes and to specific effects on organ development. This combination of genetic analysis and visualization of cell divisions observed under the

36、 microscope initiated the discoveries that are awarded by this years Nobel Prize.,Mapping the cell lineage John Sulston extended Brenners work with C. elegans and developed techniques to study all cell divisions in the nematode, from the fertilized egg to the 959 cells in the adult organism. In a pu

37、blication from 1976, Sulston described the cell lineage for a part of the developing nervous system. He showed that the cell lineage is invariant, i.e. every nematode underwent exactly the same program of cell division and differentiation.,As a result of these findings Sulston made the seminal disco

38、very that specific cells in the cell lineage always die through programmed cell death and that this could be monitored in the living organism. He described the visible steps in the cellular death process and demonstrated the first mutations of genes participating in programmed cell death, including

39、the nuc-1 gene. Sulston also showed that the protein encoded by the nuc-1 gene is required for degradation of the DNA of the dead cell.,Identification of death genes Robert Horvitz continued Brenners and Sulstons work on the genetics and cell lineage of C. elegans. In a series of elegant experiments

40、 that started during the 1970s, Horvitz used C. elegans to investigate whether there was a genetic program controlling cell death. In a pioneering publication from 1986, he identified the first two bona fide death genes, ced-3 and ced-4. He showed that functional ced-3 and ced-4 genes were a prerequ

41、isite for cell death to be executed.,Later, Horvitz showed that another gene, ced-9, protects against cell death by interacting with ced-4 and ced-3. He also identified a number of genes that direct how the dead cell is eliminated. Horvitz showed that the human genome contains a ced-3-like gene. We

42、now know that most genes that are involved in controlling cell death in C. elegans, have counterparts in humans.,Of importance for many research disciplines The development of C. elegans as a novel experimental model system, the characterization of its invariant cell lineage, and the possibility to

43、link this to genetic analysis have proven valuable for many research disciplines. For example, this is true for developmental biology and for analysis of the functions of various signaling pathways in a multicellular organism.,The characterization of genes controlling programmed cell death in C. ele

44、gans soon made it possible to identify related genes with similar functions in humans. It is now clear that one of the signaling pathways in humans leading to cell death is evolutionarily well conserved. In this pathway ced-3-, ced-4- and ced-9-like molecules participate. Understanding perturbations

45、 in this and other signaling pathways controlling cell death are of prime importance for medicine.,Disease and programmed cell death Knowledge of programmed cell death has helped us to understand the mechanisms by which some viruses and bacteria invade our cells. We also know that in AIDS, neurodegenerative diseases, stroke and myocardial infarction, cells are lost as a