细胞工程理论初级基础.ppt

1、第三章 细胞工程的理论基础,细胞培养(cell culture)技术 即是选用各种细胞的最佳生存条件对活细胞进行培养和研究的技术，是广泛应用于生命科学等研究领域的重要技术。,动物细胞与组织培养（cell and tissue culture）是动物细胞工程的重要技术基础。 动物的细胞与组织培养是指从活的机体中取出组织或细胞，模拟机体内生理条件，在体外建立无菌、适温和一定营养条件等，使之生长和生存，并维持其结构和功能的技术。,组织培养的概念 组织培养这一名词实际上是一个通用名词，习惯上泛指所有的体外培养。根据培养物的不同可概括为三个不同概念：细胞培养、组织培养和器官培养。,A：细胞培养：将组织块

2、用机械方法或酶解法分离成单个细胞，做成细胞悬液，再培养于固体基质上，成单层细胞生长，或在培养液中呈悬浮状态培养的技术称为细胞培养。,B：组织培养：将活体的一小片组织放在盛有培养液的玻璃或塑料培养器皿中，待组织块粘着后，沿底面平面移动生长的过程称为组织培养。 从组织块中生长出来的仍然是细胞，细胞在生长的同时也发生移动，至使组织培养难以长时间维持其原有结构，结果也就成了细胞培养。,C：器官培养：是指采取某些措施使器官的原基、器官的一部分或整个器官在体外存活、生长，并保持其原有结构和功能的培养技术。,体外培养的种类,二、 细胞培养的现实意义,生物技术上：生产各种生技术产品如：狂犬病、小儿麻痹 症等病

3、毒疫苗，表皮生长因子及干扰素、白 细胞介素等生长因子及单克隆抗体等。 科学研究上：在病毒学、免疫学、遗传学、肿瘤学等方面。 临床医学上：胎儿的遗传性疾病分析，药物筛选及某些疾 病的治疗等,三、细胞培养的优点,1.研究的对象是活细胞 在实验过程中，根据要求可始终保持细胞活力，并可长时间监控、检测，甚至定量评估一部分活细胞的情况，包括活细胞的形态、结构、生命活动等。,2. 研究条件可以人为控制 可以根据需要，控制包括pH、温度、氧气、二氧化碳、张力等物理、化学的条件，同时，可以施加化学、物理、生物等因素作为条件而进行实验观察，这些因素同样可以处于严格控制之下。,3. 研究的样本可以达到比较均一性

4、通过细胞培养一定代数后，所得到的细胞系则可以达到均一性而属于同一类型的细胞，需要时，可采用克隆化等方法使细胞达到纯化。,4. 研究内容便于观察、检测和记录 采用各种研究技术、记录方法： 研究: 倒置生物显微镜、荧光显微镜、电子显微镜、流式细胞术、激光共焦显微镜、免疫组织化学、原 位杂交、同位素标记- 记录: 摄影照片、缩时电影、电视-,5.研究的范围比较广泛 学科多： 细胞学、免疫学、肿瘤学、生物化学、遗传学、分子生物学等 对象广： 各种动物：低等动物-高等动物-人类 一种动物：不同年龄- 不同组织- 正常或异常（肿瘤-）,6.研究的费用相对较经济 可提供大量、同一时期、重复性好的、生物学性状

5、相似的实验对象。,四、细胞培养的缺点,现人工模拟体内环境的技术已经很高, 但, 人工所模拟的条件与体内实际情况 仍不完全相同. 当细胞被置于体外培养后, 生活在缺乏动态平衡的环境中, 久了，必然发生变化.,因此，对于体外培养的细胞，应该把他们视作一种既能保持动物体内原细胞一定的性状、结构和功能，又具有某些改变的，特定的细胞群体，而不能将之与体内的细胞完全等同。,五、细胞培养的工作原则,有标准化的工作方法 培养用的液体极多（如培养液、胰蛋白酶、HANKS液及 抗菌素等），应由专人负责，并保证做到按规程行事，配制浓度准确，灭菌可靠，所有配好的溶液瓶上都要标明名称、浓度、消毒与否和制备日期等。 一切

6、培养用品都要有固定的存放点，避免杂乱无章，其中尤其重要的是：培养用品与非培养用品应严格分开，已消毒品与未消毒品应分别存放。,第二节 组织培养的细胞生物学,一、体内外细胞的差异和分化,（一）体内外细胞的差异 培养细胞最多见的表现是：失去原有组织结构和细胞形态，分化减弱或不显，出现类似“反祖” 现象；表现为细胞趋单一化，或获得不死性，或变成具有恶性性状的细胞群。,1.与体内主要不同： 相对孤立、相对单一 缺乏体内的系统作用、失去神经体液的调节 和细胞相互间的影响,2. 主要表现 失去原有组织结构和细胞形态 分化减弱或不显 细胞趋向单一化； 3. 提示 要正确认识体外培养细胞 是一种特定条件下生长的

7、细胞群体。,二、培养细胞形态分类,体外细胞培养物的生长类型,按生长方式:2型 粘附型细胞:附着在某一固相支持物表面才能生长的细胞。 悬浮型细胞:不必附着于固相支持物表面，而在悬浮状态下即可生长的细胞。 绝大多数有机体细胞属粘附型细胞，只有少数细胞类型如某些肿瘤细胞和白细胞可在悬浮状态下生长。,体外培养细胞的分型,贴附(粘附)型细胞,粘附:是大多数有机体细胞在体内 生存和生长发育的基本存在方式 含义 两方面 结果 基于粘附特性，使细胞与细胞之间相互结合形成组织， 有机体的绝大多数细胞必须 粘附于一固相表面 才能生存和生长。,培养时：这些细胞被放到体外环境中以后,同样需要粘附于某一固相表面才能生存

8、和生长，因而属于粘附型细胞。 粘附(锚定或锚着)依赖型(性)细胞：唯有粘附于固相表面才能生存的细胞,类型 细胞在体内、外的粘附方式：存在差异 体内：粘附是全方位 外形具有复杂的立体特征 体外：多数情况，细胞只有一个附着平面 外形一般与体内时明显不同 按照培养细胞粘附生长时的主要形态，可分为几大类型,分类 根据形态大致的不同，主要2类： 上皮细胞型 成纤维细胞型 其它，不定型,上皮细胞型,名称：仅形态上似体内，实际上不完全等于- 来源：来源于外胚层，内胚层细胞 如：皮肤及其衍生物 消化道，乳腺，肺泡 上皮性肿瘤 形态：类似体内的上皮细胞 扁平，不规则多角形，中有圆形核,生长特点 易相连成片 相靠

9、紧密相连成薄层-铺石状 生长时呈膜状移动 很少脱离细胞群而单个活动,体外培养细胞类型（1）上皮细胞型,成纤维细胞型,名称：凡在培养中形态与成纤维细胞类似的 来源：由中胚层间充质组织起源的组织 如：真正的成纤维细胞 心肌，平滑肌，成骨细胞，血管内皮 形态：似体内成纤维细胞的形态 胞体梭形或不规则三角形 胞质向外伸出23个长短不等的突起 中有卵圆形核,生长特点： 排列成放射状，漩涡状 并不紧靠连成片， 细胞细胞接触易断开而 单独行动 游离的单独的成纤维样细胞， 常有几个伸长的细胞突起,体外培养细胞类型（2）成纤维细胞型,贴附生长型-类型,1. 与体内同名的细胞不完全相同 如：形态相似的成纤维细胞，

10、可不同来源 自同一动物不同组织的成纤维样细胞相似但 发展趋向不同 2. 培养细胞的形态不稳定 条件改变，细胞形态可有变化,培养细胞形态不稳定血清 Hela 高血清 低血清 成纤维细胞样 上皮样细胞 pH Hela 太酸或太碱 标准pH 成纤维细胞样 上皮样细胞 细胞密度 3T3 低密度 高密度 成纤维细胞样 上皮样细胞 生长状态改变 悬浮或贴附 悬浮 贴附 圆形 成纤维或上皮样 转化与否 未转化 转化后 成纤维样 可成上皮样,悬浮生长型,概念 培养时不贴附于底物而呈悬浮状态生长 或以机械方法使保持悬浮状态下生长 来源 自血，脾或骨髓， 尤以血中白细胞 癌肿细胞也可能 特点 在悬浮中生长良好 细

11、胞圆形，单个或小细胞团,优点 生存空间大，提供数量大 传代方便(不需消化) 易于收获 可获得稳定状态 缺点 观察不方便 很多细胞不能悬浮生长(尤以正常细胞),悬浮型,概念：培养时不贴附于底物而呈悬浮状态生长 来源：自血，脾或骨髓，尤以血中白细胞癌肿细胞 特点：在悬浮中生长良好细胞圆形，单个或小细胞团 优点：生存空间大，提供数量大，传代方便(不需消化)， 易于收获，可获得稳定状态 缺点：观察不方便，很多细胞不能悬浮生长(尤以正常细 胞),HL-60 分化细胞Giemsa染色 1. 细胞种类：HL-60； 2. 培养的天数：ATRA 1微摩尔作用5天；3. 放大倍速：倒置显微镜 X10；4. 培养

12、基种类：1640+8胎牛血清；5. 细胞状态与特征简述：悬浮细胞，分化的细胞核浆比例减小，核仁减少或 消失，胞核呈杆状或分叶状。,KU812 1.细胞种类：人嗜碱细胞性白血病细胞系；2.培养的天数：5d；3.放大倍速：倒置显微镜 X20；4.培养基种类：RPMI1640+10%新生牛血清；5.细胞状态与特征简述：细胞呈圆形，悬浮生长。,HeLa细胞1.细胞种类：人HeLa细胞传代培养；2.培养的天数：7d；3.放大倍速：倒置显微镜 X200；4.培养基种类：DMEM+10%小牛血清；5.细胞状态与特征简述：细胞呈多角形，贴壁生长。,K562细胞 1.细胞种类：K562（人慢性红白血病细胞株）；

13、2.培养的天数：传代后2天；3.放大倍数：倒置显微镜 X10；4.培养基种类：RPMI1640+10%胎牛血清，4mM Glutamine；5.细胞状态与特征简介：悬浮生长，少数贴壁，喜爱成团悬浮。,三、培养细胞的生长特点,（一）贴附,（二）接触抑制,（三）密度抑制,四、培养细胞的生长和增殖过程,（一）组织培养细胞生命期(Life Span of Culture Cells),培养细胞生命期，是指细胞在培养中持续增殖和生长的时间。包括原代培养期、传代培养期及衰退期。,正常培养的细胞周期,游离期 悬浮，胞质回缩，全部细胞变为圆球形。 吸附期 贴附底物，一般24小时内贴壁。 潜伏期 此时细胞有生长

14、活动，基本无增殖。 细胞株潜伏期一般为624小时。 对数生长期 细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进 行实验研究。 停止期（平台期） 细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂 机制：接触抑制、密度依赖性,原代培养(Primary Culture)期,也称初代培养，即从体内取出组织接种培养到第一 次传代阶段，一般持续1-4周。,特点：细胞呈活跃移动，可见细胞分裂，但不旺盛。与 体内原组织在形态结构和功能活动上相似性大。,传代期,特点：在全生命期中此期的持续时间最长，细胞增殖旺 盛，并能维持二倍体核型。,传代：体内细胞生长在动态平衡环境中，而组织培养细胞的生存环境是培养瓶、皿或其它容器，生存

15、空间和营养是有限的。当细胞增殖达到一定密度后，则需要分离出一部分细胞和更新营养液，否则将影响细胞的继续生存，这一过程叫传代。初代培养的细胞一经传代后便改称做细胞系（Cell Line）。,衰退期 特点：此期细胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖， 最后衰退凋亡。,（二）体外培养细胞一代生存期,潜伏期 指数增生期 停滞期,所谓细胞的“一代”是指从细胞接种到分离再培养的一段时间。,（三）单个细胞的生长过程,（四） 、体外培养细胞的遗传学特征,（1）核型变化,（2）永生化和恶变,（3）细胞性别,（五） 、体外培养细胞的生存环境,（一）无污染环境,（二）温度,（三）气体环境和氢离子浓度,（六） 、体外培养细

16、胞生存所需基本物质,（1）糖,（2）氨基酸,（3）维生素,（4）促生长因子,（5）其它物质,（七） 细胞冻存和复苏,细胞深低温保存的基本原理是： 在70以下时，细胞内的酶活性均己停止，即代谢处于完全停止状态，故可以长期保存。 细胞低温保存的关键： 在于通过020阶段的处理过程。在此温度范围内，水晶呈针状，极易招致细胞的严重损伤。,冻存和复苏的原则：慢冻快融,慢冻程序 4 10 分钟 20 30 分钟 80 16 - 18 小时(或隔夜) 液氮罐长期储存。,冻存管 1.2ml 2ml， 5ml,液氮罐,细胞复苏方法,（1）从液氮中取出冷冻管，迅速投入37 38水浴中，使其融化（1分钟左右）； （

17、2）5分钟内用培养液稀释至原体积的10倍以上； （3）低速离心10分钟； （4）去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。,低温保护剂的应用,在细胞冻存时加入低温保护剂，能大大提高冻存效果。 常用的低温保护剂是DMSO，它是一种渗透性保护剂。 也有用甘油的 冻存液： 含20%血清培养基 10% DMSO（或10甘油） DMSO液用培养液配好，避免因临时配制产热而伤害细胞。,细胞欲冷冻保存时，细胞浓度应该多少？,冷冻管内细胞数目一般为1106 cells/ml 融合瘤细胞则以5106 cells/ml 为宜。,细胞的运输技术,（八）细胞培养的污染和检测,细胞污染的种类: 细菌、酵母菌、霉菌和病毒 污

18、染源 : 无菌操作技术不当; 操作室环境不佳; 污染之血清; 污染之细胞 .,细菌培养液被洋葱佰克霍尔德菌污染了。 洋葱佰克霍尔德菌（Burkholderiacepacia）原属假单胞菌属，是植物病原菌。,白色念珠菌污染,真菌感染,支原体污染电镜照片, 煎蛋状和其他形状,细菌和真菌的污染和检测,肉眼直接观察法 培养检查法 显微镜观察法,. 支原体的污染和检测,Hayflick培养基直接培养法 DNA荧光染色法 PCR方法 相差显微镜观察法 测出细胞株有支原体污染时， 应直接灭菌后丢弃，以避免污染其它细胞株。,病毒的污染和检测,细胞的直接观察 动物接种检查 电子显微镜观察 免疫学检查 PCR技术

19、,第三节 建立细胞系或细胞株,一、体外培养细胞的种类和命名,（一）初代培养 (原代培养) 初代培养又称原代培养，即直接从体内取出的细胞、组织和器官进行的第一次的培养物。 一旦已进行传代培养(subculture)的细胞，便不再称为初代培养，而改称为细胞系。,原代培养,直接从体内取出的细胞进行的第一次培养物。 优点： 组织细胞刚脱离机体，生物性状尚未发生较大变化，在一定程度上能够反映体内的状态。,大鼠肝细胞原代培养 1.细胞种类：大鼠原代肝细胞；2.培养的天数：刚分离，未经培养； 细胞状态与特征简述：刚分离时球形透亮，贴壁 后呈不规则。,(二）传代培养,将细胞从一个培养瓶转移到另一个培养瓶即称为

20、传代培养 原代培养的细胞在生长、繁殖一定时间后，由于空间不足或细胞密度过大导致营养枯竭，会影响细胞的生长，因此需要进行扩大培养，即传代或称为传代培养。,HepG2细胞 细胞种类：人肝肿瘤细胞； 培养的天数：传代培养2天； 细胞状态与特征简述：呈多角型、不规则 贴壁生长，成团聚集。,根据细胞生长的恃点，传代方法有3种： 1悬浮生长细胞传代 离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新 培养液后再混匀传代。 2半悬浮生长细胞传代（Hela细胞） 此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用 直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。 3贴壁生长细胞传代 采用酶消化法传代。 常用的消化液有

21、0.25的胰蛋白酶液。,细胞传代方法,首次传代注意事项,细胞生长密度不高时，不能急于传代 ； 原代培养的贴壁细胞需控制消化时间 ； 吹打已消化的细胞应减少机械损伤 ； 首次传代时细胞接种数量要多一些 ； 首次传代培养的pH应偏低些 ； 小牛血清浓度可加大至15%20%左右 。,细胞计数,计数结果以每毫升细胞数表示 细胞计数的原理和方法与血细胞计数相同 血细胞计数器：手工计数细胞 Coulter计数仪：人工计数,细胞计数步骤,1、将血球计数板及盖片擦拭干净，并将盖片盖在计数板 上。 2、将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满 盖片和计数板之间。 3、静置3分钟。 4、镜下观察，计算计数板

22、四大格细胞总数。 细胞数/ml4大格细胞总数/ 4104 注意：压线细胞只计左侧和上方的。 镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。,培养细胞活力测定,细胞活力： 总细胞中活细胞所占的百分比 由组织中分离细胞一般也要检查活力，以了解分离的过程对细胞是否有损伤作用。 复苏后的细胞也要检查活力，了解冻存和复苏的效果。,测定方法,台盼蓝法 活细胞不被染色，死细胞染成蓝色。 流式细胞仪 细胞活性指标通常包括细胞膜对核酸染料的通透性，代谢活性，膜电位等。,四唑盐（MTT）比色法,四唑盐（MTT）商品名为噻唑蓝； MTT比色法的原理：

23、活细胞中琥珀脱氢酶能将四唑盐还原成不溶干水的蓝紫色产物甲臢 （formazan)，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。 二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比。 甲臢染料在A570nm处产生吸收值，用酶标仪测定OD值；,传代注意事项,接种数量为51048105个/ml 传代密度太低，细胞容易死亡，表现出细胞在达到增长前有较长的滞留期。 培养液由于pH下降而呈现黄色，表明细胞已经达到最大密度需要换液或进行传代培养。 如果是单层贴壁的细胞，等长满培养瓶表面，即可进行传代。,细胞系（Cell Line）,培养物开始第一次传代培养后的细胞 有

24、限细胞系（Finite Cell Line） 连续细胞系或无限细胞系（Infinite Cell Line） 肿瘤细胞系或株我国已建细胞系主要为这类细胞。 肿瘤细胞系多由癌瘤建成，多呈类上皮型细胞 具有不死性和异体接种致瘤性。,细胞株,细胞株: 用单细胞分离培养增殖形成的具特定生长特性的细胞群。 再由原细胞株进一步分离培养出与原株性状不同的细胞群，亦可称之为亚株。,克隆细胞株 从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养 或通过筛选购方法，由单细胞增殖形成的细胞群，称细 胞株。,细胞培养板 6孔， 12孔， 24孔， 48孔 96孔,二倍体细胞 培养细胞染色体数目具有与原供体二倍细胞染色体数

25、相同或基本相同(2n细胞占75或80以上)的细胞群，称二倍体细胞培养。二倍体细胞在正常情况下具有限生命期，故属有限细胞系。,肿瘤细胞系或株,是现有细胞系中最多的一类，我国已建立细胞系主要为这类细胞。肿瘤细胞系多由癌瘤建成，多呈上皮细胞型，常已传几十代或百代以上，并并具有不死性和异体接种致瘤性。,对已建成的各种细胞系或细胞株习惯上都给以名称；细胞的命名无严格统一规定，大多采用有一定意义缩写字或代号表示。但不论什么形式，均不宜太长，以便记忆和了解，今列举以下几种代表性的细胞名称供参考； HeLa： 为供体患者的性名(来源于宫颈癌) CHO： 中国地鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary) 宫743：宫颈癌上皮细胞，1974年3月建立 NIH3T3：美国国立卫生研究所(National Institute of Health)建立, 每3天传代一次，每次接种 3106细胞毫升。,细胞系或细胞株的命名,二、建立细胞系（或株）的要求,（一）组织来源 （二）细胞生物学检测 （三）培养条件和方法,何处购买细胞,ATCC（Ameri