课件PCR.ppt

1、,医学实验中心,核酸检测与PCR技术,PCR技术,PCR(polymerase chain reaction) 技术能够特异地扩增任何所希望的目的基因或DNA片段，故又称为体外基因扩增技术或DNA扩增技术。,酶活性(%),温度(),40 50 60 70 80 90 100,100 80 60 40 20,Taq DNA聚合酶引入PCR技术,PCR技术诞生,DNA片段,基因诊断,基因治疗,基因工程产品,法医学检测,人类学研究,PCR技术的基本原理,PCR技术是模仿DNA在体内的复制机制，在体外扩增特异的DNA片段，是一项DNA体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。 PCR技术

2、是在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。 PCR技术可用于基因分离克隆，序列分析，基因表达调控，基因多态性研究等许多方面,PCR相关的常用实验技术,基因组DNA的提取 PCR技术 电泳技术,DNA的提取,高分子量 高纯度,DNA提取原则,保证DNA结构的完整性 纯化后不应存在对酶有抑制作用的物质 排除有机溶剂和金属离子的污染 蛋白质、多糖、脂类等降低到最低程度 排除其他核酸分子的污染,常用的DNA提取方法,有机提取法 无机提取法 吸附材料结合法 基因组DNA纯化试剂盒,DNA提取的基本步骤,

3、准备材料,释放内容物,核酸的分离纯化,沉淀 洗涤,溶解 核酸,材料准备,最好使用新鲜材料，低温保存的样品材料不要反复冻融 提取血液基因组DNA时，要选择有核细胞（白细胞） 组织细胞培养时间不能过长，否则会造成DNA降解 含病毒的液体材料DNA含量较少，提取前先富集,细胞裂解使内容物释放,材料应适量，过多会影响裂解，导致DNA量少，纯度低 针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式： 植物材料液氮研磨 动物组织匀浆或液氮研磨 培养细胞蛋白酶K 细菌溶菌酶破壁 酵母破壁酶或玻璃珠 高温温浴时，定时轻柔振荡,核酸分离、纯化,采用吸附材料吸附的方式分离DNA时，应提供相应的缓冲体系 采用有机（酚/氯仿）抽

4、提时应充分混匀，但动作要轻柔 离心分离两相时，应保证 一定的转速和时间 针对不同材料的特点，在 提取过程中辅以相应的去 杂质的方法,核酸沉淀、洗涤、溶解,当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉淀会更充分 沉淀时加入1/10体积的NaAc（pH5.2，3M），有利于充分沉淀 沉淀后应用70的乙醇洗涤，以除去盐离子等 晾干DNA，让乙醇充分挥发（不要过分干燥） 若长期储存建议使用TE缓冲液溶解 TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase。pH值为8.0，可防止DNA发生酸解,基因组DNA的检测,提取的基因组DNA片段在20kb30kb之间 高质量的基因组DNA带型 单一无

5、拖尾现象 DNA浓度及纯度的检测： A260=1约50g/mL 双链DNA A260/280约为1.8,基因组DNA的检测,DNA浓度的测定：在波长260nm的紫外线下，1 OD值的光密度相当于双链DNA浓度为50ug/ml，单链DNA或RNA为40ug/ml，单链寡聚核苷酸为20ug/ml DNA纯度的测定：样品在260nm和280nm的紫外吸收值的比值来估算核酸的纯度。DNA260/280约为1.8，RNA约为2.0。若样品中污染有蛋白质或酚，其比值将明显低于此值,核酸检测在PCR中的意义,核酸纯度的检测：从组织中及培养细胞中分离出的DNA/RNA纯度及完整性对许多分子生物学研究至关重要，

6、如Northern印迹分析、cDNA文库的构建、体外翻译及反转录PCR等。 核酸浓度的测定：待测样本浓度太高，容易形成非特异性产物，浓度太低，可能会形成大量的引物二聚体。另外，普通PCR时，对待测样本浓度的要求不是很严格，只要凝胶电泳证明有所需的条带出现，即可定性。而定量PCR时，必须测定样本浓度。,DNA提取常见问题,问题一：DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应。,DNA中含有蛋白、多糖、多酚类杂质 DNA在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应 DNA中残留有金属离子 有RNA的存留,原因,对 策,重新纯化DNA，过吸附柱去除蛋白、多糖、多酚等杂质 重新沉淀DNA，让酒精充分挥发 增

7、加70乙醇洗涤的次数（2-3次） 加入RNase降解RNA,DNA提取常见问题,问题二：DNA降解。,材料不新鲜或反复冻融 未很好抑制内源核酸酶的活性 提取过程操作过于剧烈，DNA被机械打断 外源核酸酶污染,原因,对 策,尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融 液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前加入裂解缓冲液 在提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNA时，可增加裂解液中螯合剂的含量，细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔 所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌 将DNA分装保存于缓冲液中，避免反复冻融,DNA提取常见问题,问题三：DNA提取量少。,实验材料不佳或量少 破壁或裂解不充分 吸附或沉淀不完全 洗涤

8、时DNA丢失,原因,对 策,尽量选用新鲜（幼嫩）的材料 动植物要匀浆研磨充分；G菌、酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁。高温裂解时，时间适当延长（对于动物细胞、细菌可增加PK的用量）。 增加吸附的时间，或低温沉淀 小心操作,PCR相关的常用实验技术,基因组DNA的提取 PCR技术 电泳技术,一.PCR反应成分 1.模板DNA；2.引物；3.四种脱氧核糖核苷酸；4.DNA聚合酶；5.反应缓冲液、Mg2+等 二.PCR反应基本步骤 1.DNA模板变性 2.模板与引物退火 3.引物延伸,基因组DNA,引物,DNA聚合酶,DNA片段体外扩增,94变性,双链DNA,55退火,70延伸,2540 次循环,

9、目的片段 扩增2n倍,PCR原理示意图,PCR技术的基本过程(1),模板DNA dNTP 引物 Buffer,预变性,模板DNA dNTP 引物 Buffer,TaqDNA聚合酶,94oC 5,循 环 仪,94 55 72 ,PCR 扩增产物,72 57 min,循环2535次,PCR仪,PCR技术的基本过程(2),PCR技术的特点 高度的敏感性 高度的特异性 操作简便、快速 适用样品广泛,1）高度的灵敏性,30轮循环,扩增量达230个拷贝（109拷贝）,PCR产物每轮循环增加一倍,2）特异性,引物,引物,引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCR反应结果的关键 引物设计的最大原则是最大限度

10、地提高扩增效率和特异性；同时尽可能减少非特异性扩增,引物设计 （1)序列应位于高度保守区,与非扩增区无同源序列 （2）引物长度以15-40 bp为宜 （3）碱基尽可能随机分布,G+C占50-60% （4）引物内部避免形成二级结构 （5）两引物间避免有互补序列 （6）引物3端为关键碱基；5端无严格限制,引物设计通常遵守如下原则,A、引物与模板的序列要紧密互补。 B、引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构。 C、引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)。 D、引物长度通常在2025bp,Tm值在5565，GC含量在40%60%，产物大小在100-250bp之间。 E、引物的3

11、端避免使用碱基A；引物3端避免出现3 个以上连续相同的碱基。 F、为避免基因组的扩增，引物设计最好能跨两个外显子。 探针设计通常遵守如下原则： A、探针位置尽可能地靠近上游引物。 B、探针长度通常在2030bp，Tm值在6570，通常比引物高510，GC含量在40%70%。 C、探针的5端应避免使用碱基G。 D、整条探针中，碱基C的含量要明显高于G的含量。,3,5,3,5,限制性内切酶的识别序列 启动子序列 定点突变 探针标记,3）操作简便易行,PCR扩增法,只需要数小时,就可以用电泳法检出1g基因组DNA中仅含数个拷贝的模板序列。 通常的DNA 扩增法是分子克隆法, 首先要构建含有目的基因的

12、载体, 然后将它导入细胞后进行扩增,还要用同位索探针进行筛选;这种方法,要经过DNA内切、连接、转化和培养等相关的过程,操作复杂,一般需要数周时间。,4）用途广泛,生命学科 医学工程 遗传工程 疾病诊断 法医学 考古学,三. PCR的分类,筑巢PCR:先扩增包含待扩增片段在内的一段较长的序列,然后以其为模板再扩增待扩增片段. 共用引物PCR:用三条引物扩增两段序列,其中一条可以和另外两条为一对引物. 不对称PCR:常按1:50-1:100的比例加入两条引物,主要为获取单链DNA. 原位PCR:以组织中DNA为模板,在原位进行杂交反应. 彩色PCR:对引物进行荧光标记,这样扩增产物在荧光灯下可显

13、示彩色. 定量PCR:在反应体系中同时加入参照物,对扩增产物进行相对定量. 基因组PCR:加入引物后对整个基因组中的特异序列进行扩增.,一.不对称PCR(asymmetric PCR),不对称PCR主要是在PCR体系中设计不同的引物浓度，两条引物浓度比为1：50或1：100，前12个循环两条模板等量扩增，之后低浓度引物消耗殆尽，其扩增产物减少以至于无；而高浓度引物介导产生的扩增产物（即单链DNA）逐渐增加，可得到大量单链DNA（ssDNA）用于直接测序。,高浓度引物,低浓度引物,二.反向PCR(inverse PCR),反向PCR用于扩增已知DNA片段两侧的未知序列。,未知区域,限制性酶切,已

14、知序列,2)反向PCR (reverse PCR),是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。 可对未知序列扩增后进行分析,如探索邻接已知DNA片段的序列；用于仅知部分序列的全长cDNA的克隆,扩增基因文库的插入DNA；建立基因组步移文库。,已知序列,未知序列,未知序列,三.多重PCR(multiplex PCR),多重PCR是用多对引物同时对模板DNA上的多个区域进行扩增。 多重PCR技术的难点不是在于其原理和操作的复杂性，而是在于其多对引物的设计，必需保证多对引物之间不形成引物二聚体，引物与目标模板区域具有高度特异性。 应用于基因诊断，对与疾

15、病相关的基因（庞大）进行扩增检测。,多重PCR示意图,引物2,引物1,引物1,引物2,引物1 n,引物2 n,3）多重PCR,用于检测特定基因序列的存在或缺失。,电泳,引物,四.逆转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR),由mRNA逆转录产生cDNA链作为PCR反应模板。 逆转录合成cDNA时，引物可选用特异引物、随机六聚体引物或寡聚dT(12-18)。 设计RT-PCR的引物时最好是分散在不同的外显子上，以免基因组DNA的污染导致假阳性结果。,5,3 mRNA,逆转录,3,5 cDNA,PCR扩增,引物P1,引物P2,逆转录PCR（RT-PCR）示意图,

16、逆转录酶,杂化双链,聚合酶,五.差别PCR(differential PCR),差别PCR是将靶基因与已知拷贝的参照基因置于同一PCR反应体系中，用同一套引物进行扩增，电泳染色后可根据参照基因的扩增产物与待测基因扩增产物的相对丰度对待测基因进行定量。,六.原位（In Situ PCR，IsPCR）,原位聚合酶链式反应是由Haase等于1990年首创。它是利用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的片段，在不破坏细胞的前提下，利用一些特定的检测手段来检测细胞内的扩增产物。 直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行扩增。可进行细胞内定位。 基本步骤：组织切片或细胞固定蛋白酶消化原

17、位PCR扩增冲洗产物检测 优点：灵敏度高，可进行细胞内定位，适用于检测病理切片中含量较少的靶序列,原位PCR示意图,玻 璃 片,细胞,PCR扩增,七.荧光定量PCR(FQ-PCR),荧光定量PCR：融汇PCR技术、DNA探针杂交技术(标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团)，结合先进的光谱检测技术发展起来的一项新技术。 主要原理是在待扩增区域结合上DNA探针，PCR过程中，具有53外切酶活性的Taq酶延伸引物链到DNA探针时，将DNA探针逐个降解，释放出荧光报告基团，这样PCR体系中荧光的强度与PCR产物量之间存在正比关系，可通过测定荧光强度而对PCR产物定量。,淬灭基团,R,荧光定量PCR示意图,

18、模板DNA,DNA探针,R,Q,Q,报告基团,实时PCR技术原理,目前常用的几种PCR技术 普通PCR（包括PCR和RT-PCR） 定量PCR,普通PCR（包括PCR和RT-PCR）,PCR反应的成分,总体积：一般为25l100 l （一）无Mg2+buffer：由纯水、kcl、Tris组成。Tris用于调节反应体系pH值，使Taq酶在偏碱性环境中反挥活性。kcl可降低退火温度，但不能超过50 mmol/L，否则会抑制DNA聚合酶活性。 （二）Mg2+： Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降； Mg

19、2+过高影响反应特异性。由于dNTP与Taq酶竞争Mg2+，当dNTP浓度达到1 mmol/L时会抑制Taq酶的活性。 Mg2+能影响反应的特异性和产率。,（三） 底物（dNTPs）：dNTPs具有较强酸性，其储存液用NaOH调pH值至7.07.5，一般存储浓度为 10 mmol/L，各成份以等当量配制，反应终浓度为20200mol/L。高浓度可加速反应，但同时增加错误掺入和实验成本；低浓度可提高精确性，而反应速度会降低。 （四） Taq酶：能耐95高温而不失活，其最适pH值为8.38.5，最适温度为72。能催化以DNA单链为模板，以碱基互补原则为基础，按53方向逐个将dNTP分子连接到引物的

20、3端，合成一条与模板DNA互补的新的DNA子链。无35的外切酶活性，没有校正功能。某种dNTP或Mg2+浓度过高,会增加其错配率。用量一般为0.55个单位/100l。,（五）模板：PCR对模板DNA的纯度不要求很高，但应尽量不含有对PCR反应有抑制作用的杂质存在，如蛋白酶、核酸酶、TaqDNA聚合酶抑制剂、能与DNA结合的蛋白质 模板DNA的量不能太高，否则扩增可能不会成功，在此情况下可适当稀释模板 （六）引物：引物浓度一般为0.10.5mol/L，浓度过高会引起错配和非特异扩增，浓度过低则得不到产物或产量过低。引物长度一般1530个碱基，引物过长或过短都会降低特异性。其3末端一定要与模板DN

21、A配对，末位碱基最好选用A、C、G（因T错配也能引发链的延伸）,PCR反应条件的选择（影响因素）,温度参数： 1.变性：模板变性完全与否是PCR成功的关键，一般先于94（或95）变性310min，接着94变性3060s 2.退火：退火温度一般低于引物本身变性温度5。引物长度在1525bp可通过公Tm=(G+C)4+(A+T)2计算退火温度，一般退火温度在4060之间，时间为3045s。如果(G+C)低于50%，退火温度应低于55。较高的退火温度可提高反应的特异性 3.延伸：延伸温度应在Taq酶的最适温度范围之内，一般在7075。延伸时间要根据DNA聚合酶的延伸速度和目的扩增片段的长度确定，通常

22、对于1kb以内的片段1min是够用的,循环数,PCR的循环数主要由模板DNA的量决定，一般2030次循环数较合适，过多的循环数会增加非特异扩增产物，具体要多少循环数可通过预试验确定。 PCR产物积累规律 反应初期产物以2n呈指数形式增加，至一定的循环数后，引物、模板、DNA聚合酶形成一种平衡，产物进入一个缓慢增长时期（“停滞效应”），即“平台期”。到达平台期所需PCR循环数与模板量、PCR扩增效率、聚合酶种类、非特异产物竟争有关。,PCR常见问题之一,无扩增产物,模板:含有抑制物，含量低 Buffer对样品不合适 引物设计不当或者发生降解 反应条件：退火温度太高，延伸时间太短,原因,对 策,纯

23、化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量 更换Buffer或调整浓度 重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物 降低退火温度、延长延伸时间,现象：正对照有条带，而样品则无,PCR常见问题之二,非特异性扩增,现象：PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。,PCR常见问题之二,引物特异性差 模板或引物浓度过高 酶量过多 Mg2+浓度偏高 退火温度偏低 循环次数过多,原因,对 策,重新设计引物或者使用巢式PCR 适当降低模板或引物浓度 适当减少酶量 降低镁离子浓度 适当提高退火温度或使用二阶段温度法 减少循环次数,非

24、特异性扩增,PCR常见问题之三,拖尾,现象：产物在凝胶上呈Smear状态。,M 1 2,PCR常见问题之三,模板不纯 Buffer不合适 退火温度偏低 酶量过多 dNTP、Mg2+浓度偏高 循环次数过多,原因,对 策,纯化模板 更换Buffer 适当提高退火温度 适量用酶 适当降低dNTP和镁离子的浓度 减少循环次数,拖尾,PCR常见问题之四,假阳性（筛选转基因、检测基因表达情况),原因：靶序列或扩增产物的交叉污染,现象：空白对照出现目的扩增产物,对策： 操作时应小心轻柔，避免将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外； 除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及加样枪头等均应

25、一次性使用。 各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存。,RT-PCR,RT-PCR实验有三步：抽提RNA，RT，PCR 1.做RT前必需测RNA浓度，逆转录体系对 RNA量还是有一些要求，常用500ng或1ug 2. RT按要求做，一般不会出太大问题 3. PCR，按常规。但如需扩长片段，则对前两步要求较高，需要有完整的cDNA存在，不是单改变Mg2+浓度、退火温度能解决的,RT和PCR时的引物设计是不是一定要先知道目的基因的序列？必须,RT时，引物设计有3种方法即 a：Random 9mers b：Oligo dT-Adaptor Primer c：特异的下游引物 如果用a和b方法，是扩增的所

26、有的cDNA（理论上），还要用此产物做PCR 的模板继续扩增。 如果用c方法，那么要去哪里查它的序列呢？,RT-PCR的常用内标actin 和GAPDH的使用有选择性吗？比如不同的细胞，不同的刺激。,有关内参的建议,每一次一定要做内参的，不作内参的结果不可信。 电泳可以不一起跑，计算的是相对表达量： 1、半定量和定量RT-PCR做的都是基因相对表达量，不是绝对表达量，除非你能准确知道来自多少细胞 2、以电泳为基础的半定量RT-PCR本身是不可信的，作为实验的粗筛是可以的，但不能作为最终结果的 3、半定量RT-PCR应该在两管中进行，除非内参基

27、因和目的基因表达相同，长度差不多，GC含量相似，或者要省PCR管和taq酶,注 意 ！,在所有RNA实验中，最关键的因素是分离得到全长的RNA。而实验失败的主要原因是核糖核酸酶（RNA酶）的污染,在实验中，一方面要严格控制外源性RNA酶的污染；另一方面要最大限度地抑制内源性的RNA酶。RNA酶可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等。外源性的RNA酶存在于操作人员的手汗、唾液等，也可存在于灰尘中。在其它分子生物学实验中使用的RNA酶也会造成污染。这些外源性的RNA酶可污染器械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人员的手及各种试剂。而各种组织和细胞中则含有大量内源性的RNA酶。,防止RNA酶污

28、染的措施,1. 所有的玻璃器皿均应在使用前于180的高温下干烤6hr或更长时间。2. 塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗（注意：有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀，故不能使用）。3. 有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H2O2 室温10min，然后用0.1% DEPC水冲洗，晾干。4. 配制的溶液应尽可能的用0.1% DEPC，在37处理12hr以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22m滤膜过滤除菌。5. 操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换。6. 设置RNA

29、操作专用实验室，所有器械等应为专用。,常用的RNA酶抑制剂,1. 焦磷酸二乙酯（DEPC）：是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。2. 异硫氰酸胍：目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂，它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用。3. 氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNA酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNA酶的活性。4. RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin）：从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一

30、种非竞争性抑制剂，可以和多种RNA酶结合，使其失活。5. 其它：SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。,mRNA的分离与纯化,1. 收集细胞 组织100mg/细胞1107 2. 匀浆 加1 mlTRIZOL 匀浆（要彻底，后转至Eppendorf管） 吹打混匀，室温放置5min 加1/5体积氯仿（0.2ml） 颠倒混匀，室温放置5min 4，离心12000rpm,15min 上层水相转移到另一1.5ml Eppendorf管 3. 沉淀 加等体积异丙醇，混匀，室温放置10min 4，离心12000r,10min，弃上清 4. 洗涤 加预冷的75%乙醇1ml（用DEPC水配） 4，离

31、心7500r,5min，弃上清 空气干燥5-10min（不能完全干燥） 溶于DEPC水中（约10-20l）,或加满Eppendorf管，-20或-70沉淀40min或过夜,One Step和Two Step RT-PCR的选择,扩增效率高,Two Step RT-PCR,cDNA使用更加灵活,更多RT primer 选择,特异性primer,有效降低污染,操作简单,One Step RT-PCR,PCR相关的常用实验技术,基因组DNA的提取 PCR技术 电泳技术,概 述,电泳：带电物质在电场中向相反电极移动的现象称为电泳（electrophoresis）。 电泳现象早在十九世纪初就已发现（18

32、08年俄国物理学家Ress进行了世界上第一次电泳实验）。但电泳技术的广泛应用，则是在1937年用滤纸作为支持介质成功地进行纸电泳以后，特别是近几十年以来，电泳技术发展很快，各种类型的电泳技术相继诞生，在生物化学、医学、免疫学等领域得到了广泛应用。,电泳的基本原理,电泳是在电场的作用下而产生的物质运动，不同的物质在一定的电场强度下，由于所带电荷不同，因此受到的引力不同，向相反电极泳动速度不同进而达到分离目的。 在一定pH条件下，每一种分子都具有特定的电荷（种类和数量）、大小和形状，在一定时间内它们在相同电场中泳动速度不同，各自集中到特定的位置上而形成紧密的泳动带。这就是带电粒子可以用电泳技术进行

33、分离、分析和鉴定的基本原理。 电泳受粒子本身大小、形状、所带电量、溶液粘度、温度、pH、电渗及离子强度多种因素的影响。,电泳的分类,电泳的分类原则上按电泳的原理来分，可分为二类： 自由界面电泳：又称移动界面电泳，是指在没有支持介质的溶液中进行的电泳。其装置复杂，价格昂贵，费时费力，不便于推广应用。 区带电泳：是指有支持介质的电泳，待分离物质在支持介质上分离成若干区带。支持介质的作用主要是防止电泳过程中的对流和扩散，以使被分离的成分得到最大分辨率的分离。区带电泳由于采用的介质不同以及技术上的差异，又可分为不同的类型。,区带电泳的分类,按支持介质种类的不同，区带电泳可分为： 纸电泳：用滤纸作为支持

34、介质，多用于核苷酸的定性定量分析。 醋酸纤维素薄膜电泳：医学上，常用于分析血清蛋白、胎盘球蛋白，其优点是简便迅速，便于保存照相，比纸电泳分辨率高。 以上二种类型的电泳，由于介质的孔径度大，没有分子筛效应，主要靠被分离物的电荷多少进行分离。,区带电泳的分类,淀粉凝胶电泳：多用于同工酶分析，凝胶铺厚些，可一层一层剥层分析（一板多测）。天然淀粉经加工处理即可使用，但孔径度可调性差，并且由于其批号之间的质量相差很大，很难得到重复的电泳结果，加之电泳时间长，操作麻烦，分辨率低，实验室中已很少使用。 琼脂糖凝胶电泳：一般用于核酸的分离分析。琼脂糖凝胶孔径度较大，对大部分蛋白质只有很小的分子筛效应。 聚丙烯

35、酰胺凝胶电泳：可用于核酸和蛋白质的分离、纯化及检测。其分辨率较高。 聚丙烯酰胺和琼脂糖是目前实验室最常用的支持介质,电泳仪及电泳槽,琼脂糖凝胶电泳,琼脂糖凝胶电泳是用琼脂或琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。对于分子量较大的样品，如大分子核酸、病毒等,一般可采用孔径较大的琼脂糖凝胶进行电泳分离。 琼脂糖凝胶约可区分相差100bp的DNA片段，其分辨率虽比聚丙烯酰胺凝胶低，但它制备容易，分离范围广，尤其适于分离大片段DNA。普通琼脂糖凝胶分离DNA的范围为0.2-20kb，利用脉冲电泳，可分离高达107bp的DNA片段。,琼脂糖凝胶的特性 (1) 琼脂糖凝胶属于大孔胶，可以分析107的大分子，但电泳

36、分辨率低于聚丙烯酰胺凝胶电泳。这种大孔特性有利于免疫固定、免疫电泳和微量制备。琼脂糖形成凝胶后孔径的大小取决于琼脂糖百分浓度，如下表； 表 琼脂糖凝胶的浓度与孔径的关系,琼脂糖凝胶的特性,(2) 物理化学性质稳定，对样品吸附极小，电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好； (3)具有较高的机械强度，允许在1%或更低的浓度下使用，且在这种浓度下仍然有筛分和抗对流作用； (4)琼脂糖无毒，具有热可逆性，胶凝过程不需催化剂，制备简单、快速。低胶凝温度及低熔点的琼脂糖有利于样品回收，达到样品制备的目的； (5)琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快，染色、脱色程序简单快速；,电泳缓冲液,TAE: 40mM/L T

37、ris-醋酸 1mM/L EDTA 5：24.2克Tris 5.7ml冰醋酸 10ml 0.5M/L EDTA TBE: 45mM/L Tris-硼酸 1mM/L EDTA 5： 54克Tris 27.5克硼酸 10ml 0.5M/L EDTA,6样品缓冲液,30mM EDTA 0.25% 溴酚蓝 0.25% 二甲苯氰 36% 甘油水溶液,操作步骤,1.琼脂糖加电极缓冲液水浴或微波炉融化，加 EB终浓度0.5ug/ml.,操作步骤,2. 样品端在负极 1-5V/cm 指示剂接近凝胶的另一端 3. 紫外灯观察条带并拍照。,由丙烯酰胺和N,N-甲叉双丙烯酰胺在引发剂和增速剂作用下聚合而成。 其机械

38、性能、弹性、透明度、孔径大小都和两个参数有关： T:两个单体的总百分浓度 C:交联百分浓度,T,a+b,m,b,100%,=,C,=,a+b,100%,a: 丙烯酰胺的克数,b:N,N甲叉丙烯酰胺的克数,m:缓冲液体积ml,聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamidegelelectrophorsis，PAGE),PAGE,引发剂：丙烯酰胺的聚合是化学过程，一般由过硫酸氨作引发剂过硫酸铵在碱性条件下产生游离氧自由基，引发单体丙烯酰胺成为自由基状态，产生聚合。 加速剂：N,N,N,N- 四甲基乙二胺（TEMED)：催化过硫酸铵产生自由基，加速聚合过程。 丙烯酰胺和N,N-甲叉丙烯酰胺液体有神

39、经毒性，可经皮肤吸收。,凝胶浓度和交联度与孔径大小的关系,凝胶孔径大小，主要受凝胶浓度的影响。凝胶浓度越大，孔径越小。凝胶浓度过大，胶硬而脆，易折断。浓度过小，凝胶稀软，不易操作，也易断裂。 当凝胶浓度确定后，交联度为5%时，凝胶具有最小孔径，超过5%或低于5%时凝胶孔径都要增大。,聚丙烯酰胺凝胶电泳,荧光定量 PCR,为什么要用定量PCR而不是定性PCR？,单纯PCR所提供的只是阳性或阴性结果，在阐述许多问题的本质时，基因及其表达的量起着至关重要的作用。 定量PCR常用估计病毒的负荷量、监测临床治疗进展或用于诊断遗传缺陷等。通过对靶基因量的检测，将其与疾病的临床表现、临床分型以及各种标志酶的

40、值联系起来，为疾病的诊断和药物疗效监测提供科学的依据。 在一定程度上消除了单纯PCR过于敏感、假阳性率高的缺点。, 实时在线监控 对样品扩增的整个过程进行实时监控，能够实时地观察到产物的增加，直观地看到反应的对数期 降低反应的非特异性 使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合，提高了PCR反应的特异性 增加定量的精确性 全程监控，定量与扩增同步进行,准确的进行定量 结果分析更加快捷方便，无需跑胶 重复性好、测定偏差小,荧光定量实时PCR与普通PCR的比较,通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对结果进行分析，计算待测样品的初始模板

41、量。,荧光定量PCR技术,在PCR反应体系中加入荧光集团,利用荧光信号的积累,实时监控整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析,荧光定量实时PCR主要原理,荧光定量PCR标记方法 内掺式染料 SYBR Green I 序列特异性探针 Taqman Molecular Beacons Dual Probes(FRET) 特异性引物 Amplifluor (Intergen) Lux引物 阴阳探针 在Rotor-gene3000研发,Excitation,SYBR-Green I,SYBR-Green I,SYBR-Green I 的应用,起始模板浓度定量 融解曲线分析 -可区分单一

42、产物、变异产物、多种产物和（或）引物二聚体 基因型分析,SYBR-Green I 的优点 使用方便 -不必设计复杂的引物 没有序列特异性 -可以用于不同的模板 便宜 灵敏 SYBR-Green I 的缺点 与非特异性产物结合,双标记探针（Taqman Probe）,Taqman的应用,定量起始模板浓度 基因型分析 产物鉴定 SNP(单核苷酸多肽性)分析,Taqman 的优点 对目标序列有很高的特异性 -特别适合于SNP检测 与Molecular Beacons 相比设计相 对简单 Taqman 的缺点 价格较高 只适合于一个特定的目标 不能进行融解曲线分析,X,分子信标（Molecular B

43、eacon Probe）,定量起始模板浓度 基因型分析 鉴定产物 单核苷酸多态性（SNP）检测,分子信标的应用,分子信标的优点 对目标序列有很高的特异性 用于SNP检测的最灵敏的试剂之一 荧光背景低 分子信标的缺点 设计困难 无终点分析功能 只能用于一个特定的目标 价格较高,SYBR Green I 法与探针法比较,mRNA表达量的分析,SNP解析、基因型的分析,简便易行,探针法,价格便宜,要求反应的特异性,不能进行多重PCR,探针合成费用高,探针设计要求高,多重PCR检出,特异性高,SYBR Green I 法,如何设计荧光定量PCR实验方案？具体问题要具体分析哦！,基因序列的查找引物探针合

44、成标记 标准品的制备荧光定量PCR方法的确定引物探针合成标记标准品的制备反应液的配制反应条件的设定基线的设定，数据分析 1)大量阅读相关的背景资料后，在genebank中找到相应的自己所要研究基因序列。（） 2)用引物设计软件Primer5.0、Oligo6.0或beacon designs3.0进行引物探针的设计； （下载）,荧光定量PCR的应用,Absolute Quantitation Relative Quantitation,Gene of Interest (Target) = The gene being investigated Hous

45、ekeeping Gene (Reference) = Normalizes for variations in starting template Standards = Used to extrapolate unknown concentrations and calculate efficiencies Sample = Are unknown entities, can be treatments, disease state etc. Calibrator (Control) = Are known entities, for example not treated with dr

46、ug X Ct Value (Crossing Point) = Cycle number at which the set threshold crosses (must be in exponential phase) Efficiency(Amplification value) = The rate of amplification,Terminology,Unknown samples are compared with a standard curve with known concentration values,Must be amplified using the same

47、primers as the gene of interest and amplify with the same efficiency. Standards must be quantified accurately (e.g. UV spectrophotometer) Standards must be normalized (e.g. to number of cells). Same threshold settings must be used for each set of experiments to determine Ct values.,Criteria for Stan

48、dards,荧光域值（threshold）的设定,PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准差的10倍，即：threshold = 10 SDcycle 3-15,Ct值的确定,CT值的含义：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经用的循环数,说明：该实验为灵敏度检测试验，该实验最低可检测到单拷贝数基因。不同浓度梯度稀释的HBV阳性标准品，1号管为单拷贝基因。 该实验R值为0.9987，扩增效率为97%（见下表格）。此次试验1-9号管分别为,单拷贝基因,Rotor-gene3000曾检测到6-20个拷贝数的SARS病毒,(一)目的基

49、因扩增曲线,标准曲线,融解曲线,(二) 扩增曲线(目的基因+内参),融解曲线(目的基因+内参),标准曲线,管家基因GAPDH检测结果,管家基因GAPDH检测结果,目的基因PAH检测结果,目的基因PAH检测结果,管家基因 GAPDH 目的基因 PAH 定量结果平均值定量结果平均值通过GAPDH校正的PAH校正值小鼠肝脏和脑中 PAH的相对表达量 样品a1 15320 14432.512640 12042.50.834 5931 14040 10980 样品a2 14040 11210 14330 13340 样品b1 25180 251402.278 3.541.40710-41 24680 3

50、.713 样品b225690 4.821 25010 3.336,相对表达量柱形图,4通道同时采集数据的界面,Taqman探针技术用于等位基因的检测,分别设计针对不同等位基因的有不同荧光剂标记的探针，加入到一个管子中竞争性反应，当仅有一种目的基因存在而无其他等位基因时，只有一种探针能与目的基因正确配对而杂交产生荧光，其他探针发生错配，导致错配探针上荧光剂的无效切割，从而无荧光产生.当有等位基因存在时，至少两种探针发生杂交，产生不同颜色的荧光，因此，仅一种荧光信号增强提示样本的纯合性（无等位基因存在），多种荧光信号同时增强则提示异质性（有等位基因存在）,PCR方法的灵活性使它们在基因突变或等位基

51、因变化检测上具有独特的优势。应用分子灯塔技术实时检测methylenetetrahydrofolate reductas基因的C-T突变，分析45个样本，结果为8个突变纯合子，17个杂合子和20个野生型纯合子。Tyagi使用多个不同颜色荧光剂标记的分子灯塔加入一个反应体系中，达到了检测多个点突变的目的,点突变/等位基因突变检测,次甲基四水化合物还原酶,(三) 等位基因分析,杂合型,突变型,阴性,野生型,Experiment Example,Using Two Standard Curves,定量PCR引物设计通常遵守如下原则,A、引物与模板的序列要紧密互补。 B、引物与引物之间避免形成稳定的二

52、聚体或发夹结构。 C、引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)。 D、引物长度通常在2025bp,Tm值在5565，GC含量在40%60%，产物大小在100-250bp之间。 E、引物的3端避免使用碱基A；引物3端避免出现3 个以上连续相同的碱基。 F、为避免基因组的扩增，引物设计最好能跨两个外显子。,探针设计通常遵守如下原则,A、探针位置尽可能地靠近上游引物。 B、探针长度通常在2030bp，Tm值在6570，通常比引物高510，GC含量在40%70%。 C、探针的5端应避免使用碱基G。 D、整条探针中，碱基C的含量要明显高于G的含量。,荧光定量PCR常见的几个问题,1）、文

53、献上找到的引物和探针序列能否直接使用？ 2）、在实验之前要进行哪些准备工作？ 3）、标本的采集和处理应该注意什么问题？ 4）、在做荧光定量实验时要注意些什么呢？ 5）、为什么阳性对照一直没有扩增曲线？ 6）、为什么阴性对照一直有扩增曲线出现？,PCR目前涉及到的领域,临床医疗领域病原体的检测和基因诊断，包括特定基因的检测、寄生虫和细菌等病原体的检测 新药的开发和研究 粮油、食品的商检，包括食品卫生检验，转基因作物的饿检验 法医的遗传学鉴定 基础研究中基因表达丰度的测定 差异基因的表达检测，特定基因的验证 环境监测，包括水质、空气的污染检验, 动物疫情检测 新的防止疫情发生和控制的药物及方法的研

54、究 转基因动物中目的基因拷贝数与品质关系的研究和早期筛选。,一、动物学研究应用,使用TagManPCR方法对泰勒尔梨姜虫 进行诊断及定量,泰勒尔梨姜虫是导致牛群中持续性泰勒尔梨姜虫病的致病原。感染泰勒尔梨姜虫会在牛群中，特别是在野外饲养的牛群中，导致慢性贫血及发热。在本次研究中，我们使用特异性针对病原体T的33个KD的基因片断的引物，应用聚合酶链反应（PCR）对寄生虫进行诊断和定量。与传统的对从牛群采集的血进行显微镜观察，Gimsas染色方法比较，TagMan PCR方法对寄生虫血症的检出特异性高达0.00005%。另外还发现，这种方法能评估牧群中感染的相对程度。现今的研究表明这种方法不仅可以

55、用来检测泰勒尔梨姜虫的感染，还可以对牛群的寄生虫血症程度进行评估，因此该方法可以用来监测地区的健康状态,Wooseog J, Kweon CH, Kang SW, Paik SG. Diagnosis and quantification of Theileria sergenti using TaqMan PCR. Veterinary Parasitology. 2003; 111: 287-295,参考文献,实时PCR方法评估欧洲比目鱼上CYP1A感应的动物间差异。使用SYBR-GREEN在RG2000上对CYP1AmRNA进行定量。,Application of real time P

56、CR determination to assess interanimal variabilities in CYP1A induction in the European flounder(Platichthys flesus)Marine Environmental Research 54(2002)267-270,参考文献, 转基因植物中基因拷贝数与性状的关系。 检测转基因植物中基因拷贝数的变化。 转基因植物株早期的筛选。 转基因成分的转移。,二、植物学方面,研究表明可以通过基因工程技术，将Rpg1转基因入容易感染茎锈病的大麦后，后者即可以获得对茎锈病的抵抗力。用SYBR GREEN在

57、RG2000上对Rpg1mRNA进行定量,HenrietteHorvath,* NilsRostoks,* RobertBrueggeman,* BrianSteffenson, Ditervon Wettstein,* and AndrisKleinhofs* Genetically engineered stem rust resistance in barley using the Rpg1 gene Horvath et al.Proc Natl Acad Sci U S A. 2003 Jan 7;100(1):364-9. Epub 2002 Dec 30.,参考文献,PCR技术在

58、医学上的应用,PCR技术在医学上的应用,一、PCR技术在法医学上的应用 PCR技术在法医学中的应用是检测人类白细胞抗原-DQ位点的分型，另外，Y染色体特异DNA (DYZ1、DYZ3) SRY基因的PCR分析使性别鉴定成为常规。 在Y染色体上只要缺失SRY，个体就发育成为女性。 用针对SRY基因和X、Y同源序列的两对引物进行PCR扩增，只有男性出现299bp的扩增片段。用这种方法鉴别胎儿、运动员、犯罪人员等的性别，准确率极高。,二、遗传病相关基因的检测 遗传性疾病根据其遗传方式分为单基因遗传病和多基因遗传病。因此，在诊断遗传性疾病时又分为等位基因检测、多基因遗传病的突变检测和基因表达异常所致遗传病检测。如果碱基突变的位置与某种限制性内切酶的识别位点相关，突变会产生新的或