发酵生产染菌及其防治.ppt

1、第七章 发酵生产染菌及其防治,纯种培养要求必须防止杂菌污染 为防止染菌，采取了一系列措施： 密闭式发酵罐、无菌空气、无菌室、培养基和设备灭菌、严格的无菌操作、改进生产工艺等。,染菌无法彻底避免；据报道，国外抗生素发酵染菌率为25%，国内抗生素发酵、青霉素发酵的染菌率为2，链霉素、红霉素和四环素发酵染菌率为5%，谷氨酸噬菌体感染率为12 染菌对发酵产率、质量、三废治理都有很大的影响。 发酵染菌后，一定要找出染菌的原因，以总结防治发酵的经验教训，且积极采取必要的措施，防止生产过程中染菌，把染菌消灭在发生之前。,一、染菌对不同发酵的影响 青霉素：产青霉素酶的杂菌 疫苗：全部废弃 柠檬酸：主要防止前期

2、染菌 谷氨酸：噬菌体危害大 肌苷、肌苷酸：易染菌,第一节 染菌对发酵的影响,二、染菌发生的不同时期对发酵的影响 （1）种子培养期染菌：发现种子染菌应灭菌后弃去，并对种子罐、管道进行检查和彻底灭菌。 （2）发酵前期染菌：易染菌、应特别防止，可重新灭菌，补充营养，重新接种发酵。,（3）发酵中期染菌： 发酵中期染菌，挽救处理困难，危害性大； 抗生素发酵： 将另一罐发酵正常、单位高的发酵液的一部分输入染菌罐中，以抑制杂菌繁殖，同时采取低通风，低流加糖量等措施 柠檬酸发酵： 污染细菌：加大通风量，加速产酸，降低pH，抑制细菌生长； 污染酵母 ：加0.025-0.035g/L硫酸铜；,污染黄曲霉；加入另一

3、罐将近成熟的醪液，使pH下降，黄曲霉自溶 污染青霉：青霉能在低pH环境下生长，可考虑提前放罐。 （4）发酵后期染菌 产物积累较多，营养物即将耗尽。如染菌量不大，可继续发酵；如污染严重可考虑提前放罐。,四、染菌程度对发酵的影响 染菌程度越大，即进入发酵罐的杂菌数目越多，对发酵的危害越大。 如果生产菌已在发酵液中占优势，污染少量杂菌，对发酵不会造成太大的影响。 前期和中期染菌，应结合染菌程度综合考虑。,第二节 发酵染菌的途径分析,（一）发酵染菌后的异常表现 罐温异常升高 发酵液pH异常变化 溶解氧及CO2水平异常 菌丝黏度的异常变化 发酵液气味的异常变化 发酵液中碳、氮含量的异常变化 发酵液中产物

4、量的异常变化 泡沫异常 菌体太浓或太稀,二、染菌的检查与判断 1、染菌的检查 （1）显微镜检查法（最简单、最直接、最经常）：观察微生物的形态特征，检查是否有与菌种形态特征不一样的其他微生物在存在。 （2）平板划线培养或斜面培养检查法； 平板制好后，应先保温24小时，确定无菌；划线后分别于37、27培养，一般24h后镜检是否有杂菌。,（3）肉汤培养基检查法（酚红变色pH6.8-8.4） 样品直接接入灭菌的肉汤培养基中，分别于37、27培养，随时观察，并取样镜检。 噬菌体检测时，用双层平板法，底层为肉汤培养基，上层琼脂减量，指示菌为生产菌。,无菌实验时，如果肉汤连续三次发生变色反应（红色变为黄色）

5、或产生混浊，或平板培养连续三次发现有异常菌落，可判断染菌。 有时肉汤培养的阳性反应不够明显，而发酵样品的各项参数确有可疑染菌，经镜检等其它方法确认连续三次样品有相同类型的异常菌存在，也可判断为染菌。 无菌实验的肉汤或平板应保存并观察至本批放罐后12h，确认无菌后才能处理。无菌试验期间应每6h观察一次无菌试验样品。,三、发酵染菌原因分析 发酵的染菌率（指一年内发酵染菌批数与总投料批数之比）,发酵染菌批数,总投料批数,总染菌率,100,染菌率与发酵的菌种、培养基、产品性质、发酵周期、生产环境条件设备和管理技术水平等有关。,染菌原因分析 染菌原因分析就是总结染菌的教训，防范于未然。 主要染菌原因：种

6、子带菌，无菌空气带菌，设备渗漏，灭菌不彻底，操作管理不当。,（一）染菌的杂菌种类分析 杂菌是耐热的芽孢杆菌（灭菌、死角） 杂菌是不耐热菌（种子带菌、空气带菌，设备渗漏，管理操作等） 杂菌是真菌（可能是设备或冷却盘管渗漏、无菌室灭菌不彻底或无菌操作不当）,（二）染菌的规模分析 大批量发酵罐染菌：种子、空气； 前期：种子带菌，灭菌问题； 中后期：空气带菌； 部分发酵罐染菌：前期（种子染菌、连消系统灭菌不彻底）；后期（可能是中间补料染菌） 个别发酵罐连续染菌：大都是由于设备渗漏,（三）染菌的时间分析 种子培养阶段：种子、灭菌、接种操作或设备因素； 发酵前期：种子、灭菌、接种操作、空气带菌等； 发酵后

7、期：空气、补料、设备渗漏、泡沫顶盖、操作问题,第三节 杂菌污染的途径和预防 一、种子带菌的防治 种子带菌原因： 斜面菌种染菌、培养基和器具灭菌不彻底、种子转移接种过程染菌和种子培养设备装置污菌等。,种子带菌的防治方法： （1）严格控制无菌室的污染，交替使用多种方法对无菌室灭菌。 （2）制备种子时对砂土管、斜面、三解瓶及摇瓶均要严格管理，防止杂菌进入。 （3）对每一级种子严格进行无菌检查，确保任何一级种子未受杂菌感染。 （4）培养基及用具灭菌要彻底，高压灭菌时要完全排净冷空气应防止假压,达到不到所需的温度；,二、空气带菌及其防治,空气带菌是发酵染菌的主要原因之一。,二、空气带菌及其防治,措施：从

8、空气净化流程和设备设计、过滤介质的选用和填充灭菌和管理方面完善，加强卫生管理，减少含菌量，正确选择采风口，设计合理工艺，加前置粗过滤器、降低空气湿度、保持过滤介质干燥、防止空气冷却器漏水等,三、操作失误导致染菌及防治 主要指培养基和设备灭菌不彻底 原料性状：淀粉质原料，升温过快或混合不均匀，易结块，团块中包埋的活菌不易杀灭；措施：可升温前搅拌和加淀粉酶。 麸皮、黄豆饼等固形物溅到罐内各种支架上，堆积不易彻底灭菌。措施：预先配料 实罐灭菌时未充分排除罐内空气：造成假压，升温时，应打开排气等阀门放气。,灭菌中产生泡沫，严重时可升至罐项，泡沫内带菌，温度低于灭菌温度，导致存活。措施：措施消泡剂，严防

9、泡沫升顶。 连续灭菌时，温度和时间要符合要求。蒸汽压力波动大，培养基未达到灭菌温度，导致灭菌不彻底。,四、设备渗漏或“死角”造成的染菌及其防止 设备渗漏：指发酵罐、补糖罐、冷却盘管、管道阀门等，由于化学腐蚀、电化学腐蚀、磨蚀、加工制作不良等形成微小漏孔后发生渗漏染菌。 “死角”：由于操作、设备结构、安装及其他人为因素，使蒸汽不能有效到达预定的灭菌部位。如盘管、空气分布管、发酵罐部件、管件等。,常见的设备、管道“死角” 发酵罐的“死角”：不锈钢衬里破裂造成死角，发酵罐罐底脓疱状积垢。,管道安装不当形成的死角,五、噬菌体污染和防治,噬菌体是细菌病毒，可通过环境污染、设备渗漏或“死角”、空气系统、培

10、养基灭菌、补料过程及操作过程等环节进入发酵系统。 利用细菌或放线菌发酵的生产易受噬菌体的污染，由于噬菌体的感染力非常强，传播蔓延迅速，较难防治，对发酵有很大威胁。,噬菌体污染症状,氨基酸发酵中，光密度不上升或回降；pH逐渐上升，可到8.0以上；氨的利用停止；糖耗、升温缓慢或停止；产生大量泡沫； 谷氨酸产量少，甚至找不到完整的菌体，CO2排出量异常； 发酵周期延长； 发酵液泡沫多、难中和取分离困难，收率低。,（1）、噬菌体的防治 是一项系统工程，从培养基制备灭菌、种子培养、空气净化系统、环境卫生、设备、管道等诸多方面，具体归纳如下： 严格活菌体排放，切断噬菌体的来源 做好环境卫生，消灭噬菌体与杂菌 严防噬菌体与杂菌进入种子罐或发酵罐内 抑制罐内噬菌体的生长,（2）、污染噬菌体后的处理方法 并罐法 转换使用菌种或使用抗性菌株 放罐重消法 罐内灭噬菌体的方法,六、杂菌污染的挽救与处理 1、种子培养期染菌的处理 灭菌、重新制种、倒种 2、发酵前期染菌的处理 重新灭菌接种发酵、危害较大的可入掉部分料液，补充