ChitosanPBMSCs可注射组织工程骨用于骨质疏松种植修复的初步研究.doc

1、 军医进修学院;解放军总医院博士学位论文Chitosan/PB-MSCs可注射组织工程骨用于骨质疏松种植修复的初步研究姓名：刘世森申请学位级别：博士专业：口腔临床医学指导教师：刘洪臣20090501 军医进修学院博上学位论文骨质疏松是以骨量减少、骨组织显微结构退化为特征的一种系统性骨代谢疾病。颌骨作为全身骨骼的一部分，与全身其他骨骼一样会受到骨质疏松的影响，导致颌骨内骨组织的数量乖质量下降，使种植体植入后愈合时间延目的：研究外周血是否可以与骨髓一样作为骨组织工程种子细胞来源。 军医进修学院博士学位论文结果：盐酸浓度越低，消毒造成的壳聚糖溶液粘度损失越小，所获得的实验三去势法骨质疏松兔模型的建立

2、及下颌牙槽骨的改变去势法建立兔骨质疏松模型并观察下颌牙槽骨的改变。 军医进修学院博士学位论文察颏孔附近骨形态，光镜下测量下颌中切牙内侧骨层厚度，拍片后使用疞；疞，；术后哂诩偈质踝值：明显低于假手术组，。实验四可注射组织工程骨用于骨质疏松种植修复的初步探索目的：将可注射组织工程骨安全有效的应用于种植体研究，初步观察其在骨质疏松状态下修复种植体周围骨量不足的效果。方法：只正常新西兰兔分为椋孔玪 结果：可注射组织工程骨；骨质疏松；骨整合；种植部位骨量不足 军医进修学院博上学位论文 瓵猺 猧， 一籫 瓵 瓵 甌，瓸琍痗 甌 军医进修学院博十学位论文 甌 军医进修学院博十学位论文， ； 军医进修学院博士

3、学位论文胰岛素样生长因子抗酒石酸酸性磷酸酶间充质干细胞甲基噻唑基四唑骨钙素 军医进修学院我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不含为获得我院或其他教育机构的学位及证书而使用过的材料，对本文的研究作出贡献的个人或集体，均已在文中做了明确的说明并表示谢意。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。忙、军医进修学院 如骨质疏松，影响牙槽骨的质与量，进一步影响种植体的愈合过程，因而被认为是种植牙治疗的禁忌症或者相对禁忌型引。特殊设计的种植体在植入这些患者体内后，面临着双重不

4、利因素：种植体特殊的结构和系统性疾病引起的病理微环境，这种复杂情况有可能导致种植体愈合不良。为了保证种植体顺利愈合并达到良好的骨整合状态，需要采取一些特殊的处理措施。种植牙长期稳定的发挥功能构成了威胁。此外，骨质疏松加快剩余牙槽嵴吸 军医进修学院博士学位论文注射、挤压、抽吸等操作的影响。这些研究提示，构建一种可注射组织工程骨，注射到萎缩的牙槽骨表面，或在能够获得初期稳定性的同时，将可注射组织工程骨应用到种植体骨外悬空部分周围，代替自体骨进行牙槽骨增高术，有可能收到比较好的治疗效果。此外，将其应用到种植体骨内部分周围，在局部提供更多的成骨细胞和或生长因子，有可能会更快的形成更多的骨组一，统性疾病

5、的不利影响，降低特殊种植体愈合不良的风险。：甀瓹 甌琂琕琍： 军医进修学院博十学位论文实验一兔骨髓与外周血间充质基质细胞的体外培养实验材料速眠新长春军需大学兽医研究所肝素钠长沙湘仪离心平衡机制造公司美国公司美国公司美国公司美国公司 阄路跸涿拦鶷公司试剂盒北京天根生物技术有限公司型电泳仪北京六一仪器厂铁苏木素：簂漳舅厝苡旌希偌觢蒸馏水。河隑液现用现混。 军医进修学院博十学位论文离心占煜赴厦娴陌紫赴患悖砑拥矫芏任，培养液转逑次。空气、的孵箱中。后全量换液：骨髓的培养液直接弃去不再重复培养；外周血的培养液 军医进修学院博十学位论文量换液。传代培养原代培养过程中大部分细胞集落达到融合后，表面分子标志鉴

6、定 军医进修学院博士学位论文离心分钟，将最上层转移到新管中。街鵆湃收集管中，离心秒，倒掉那碇牵缪古种蛹觳釸的完整性。 军医进修学院博十学位论文罬荆瑅绫所示配制扩增体系使用量 畉觥从跫#嬖湫湫，退火温度复性延伸鲅罚婧嬷昭由。成脂诱导成骨诱导取代细胞，用成骨诱导液培养，每半量换液。进行型胶 军医进修学院博学位论文形成情况。首次换液时，瓶底可见成纤维细胞样细胞形成的细胞集落，细胞之间紧图淄霉撬柙嘌峁菏状位灰菏钡南赴洹赴锼笮巍切危一个细胞突起。在细胞中央有 继续扩大达到融合。达到融合时，中心部分梭形细胞与圆形细胞混杂在起梭形细胞可在小范罔内可形成平行的舟状捧列。鉴于这种细胞集落 。鉴于这种细胞集落能够

7、达到融合且在 犁医进修学院博学位论文骨髓传代牛长铺满时细胞呈梭形，排列为漩涡状。多角形细胞排列成铺路石样 军医进佳学院博士学位论文图撬栌胪庵躮来源细胞表面分子标志物表达情况疉觳庀允玖阶檠鸨局首躌量基本相同。 外周血米源细胞形成的复层生长有序性差细胞杂乱的排，在一起，投有明显顺序 军医进恬学院瞎学位论文。外周血来源细胞诱导后皱缩仍不明显，在部分皱汗撬杳自吹南赴晒怯盏螅琁型胶原表达阳性。和庵苎丛吹南赴晒怯盏肌昂螅型肢原表选阳性。骨髓来源细胞诱导后矿化结节形成广泛，部分矿化结节肉眼即可分 图幼兔外周血与骨髓来源细胞成骨诱导时矿化结节形成情况虽然成骨诱导液中没有血管内皮细胞分化诱导剂，在铺路石样区域有

8、散 军进恬学院博十学位论文圄囊逐渐萎缩、数目减少。与周围致密的细胞排列对比明显。 军医进修学院博士学位论文狹更为适宜。性贴壁阻止了细胞的贴壁和生长，导致部分细胞不能贴壁，这也是再次培养自分泌的、自身繁殖所需的细胞因子的浓度快速升高。 军医进修学院博士学位论文结合这些研究，使用外周血作为骨组织工程种子细胞的来源具有以下优可能同时提供成骨细胞、血管内皮细胞等多类种子细胞用于血管化组织工程骨的构建。但是由于外周血中间充质基质细胞的数量极少，在血液样本量不大的情况下培养成功比较困难。创伤【】、集落刺激因子动员等情况下虽然能够提高培养成功率，但是应用于临床的可能性不大，如何提高正常状态下的培养成功率有待

9、于进一步研究。 军医进修学院博士学位论文篐甂；： 珼琇：一 ： 主要实验材料与仪器测量仪上海精密仪器厂盐酸北京化工厂磁力搅拌器上海司乐仪器有限公司电热恒温水浴锅精确称量壳聚糖，置于烤箱中烘烤，再次称重后测算本批次壳聚糖样品，溶于疞定游离盐酸。当溶液颜色由紫红变为蓝绿时，记录耗用氢氧化钠体积，按照 ，溶于双蒸水至终体积为中，制成疞。高温溶解的为椋篛 军医进修学院博士学位论文取三组作为包囊种子细胞的壳聚糖凝胶。在包囊种壳聚糖含水量与脱乙酰度壳聚糖溶液性状 军医进修学院博十学位论文消毒前各纽壳聚糖盐酸溶液外观。椤组澄清椤组有少量壳聚糖粉末未能溶解过程中壳聚糖溶液的粘度变化差异较大。椤组在壳聚糖完全

10、左削：壳聚糖凝腔配制完毕时尚未凝州，此时依然是溶液形式。澄清有一定流动性右幽：壳幕糖凝胶凝瑚后变为内色，无流动性。 河朐诙矫媾嘌辈煌怪孟晕礔细胞在壳聚糖凝胶内主要里圆形。蛇结晶，绝大部分细胞投有着色。不能摄取的死细胞只占少数。 军医进修学院博士学位论文壳聚糖简介的一种线性聚糖。在体内，壳聚糖通过溶菌酶的水解作用降解，先是降解为分子量较小的壳寡糖，最终生成可被机体直接吸收氨基葡萄糖。壳聚糖结构中含有可衍牛化的羟基和氨基，能进行衍牛化反应加入不同的基团，赋予壳聚糖特殊的生物活性，调节壳聚糖的理化性质。目前壳聚糖在食品业、纺织业、农业、医学等各个领域内都有广泛的应用。壳聚糖的丰要医学功效有：抗心肌缺

11、血和心率失常、降血脂防止动脉粥样硬化、促进凝血旧与抗凝血腔、免疫调节和免疫佐剂效应、抗肿瘤作用、抑菌作用。在口腔壳聚糖支架材料在组织工程中的应用细胞支架材料必须有足够大的表面积以便于细胞粘附，因此疏松多孔材料比普通固体材料表面更有利于细胞培养。支架材料的孔径和孔隙率直接影响细胞的牛长速率和繁殖速率，壳聚糖可通过冷冻干燥法制备成多孔结构材料，且其孔径和孔隙率都易于控制，可通过改变冷冻温度和壳聚糖溶液浓度来实现，孔的取向则通过改变冷冻速度来控制。但是，壳聚糖支架柔软、延展性好，其力学强度不够，一般较多的用于皮肤组织工程。在加入一定量的粉末状无机基质后，壳聚糖支架的力学性能得到很大改善，可望用于骨组

12、织选择壳聚糖凝胶作为支架材料的原因复方面具有广泛适用性和优点【 间降解产物，壳寡糖，对去势后大鼠的骨质疏松有一定治疗作用，可以改善 壳聚糖凝胶中细胞的活力保持大部分研究中一的浓度都在笥遥踔粮叽】。高渗透压对细胞会产生损害，也会在注入人体后导致人体组织的损伤。【】曾尝试在壳聚糖溶液中加入羟乙基纤维素来达到降低用量的目的，但是仔细的研究对比后发现，在羟乙基纤维素商品化生产过程中作为反应催化剂之一的戊二醛才是导致用量减少的根本原因。甋的制备特性初步研究中国修复重建外科杂志； 军医进修学院博上学位论文；甂； 甌琒：琈 ，甖甋 甊狦甀琂曹强，毛天球，顾晓明，等氯化钙对成骨细胞增殖和分化的影响中国甁 主要

13、实验试剂与仪器长春军需大学兽医研究所戊巴比妥钠检测试剂盒南京建成生物 军医进修学院博学位论文自腹部中央开腹寻找卵巢，手术幽中白箭头所指的耪色组织即为卵巢骨代谢指标检测集血清，采用放射免疫法测量表达水平，使用检测试剂盒按照使术后处死所有实验用兔，取下颌骨固定于中性甲醛，快速脱矿然中脱矿。脱矿至符合石蜡切片要求后，庋趸浦泻停琘全自动生物组织脱水机上脱水至根下方内侧部分骨质的面积比。 军进佳学院博学位论文图鹾月下颌骨颏孔附近骨组织微结构变化 伴有错位愈合不良，礏过低而未能在本实验条件下测出，表明发生了严重的骨质疏松，新西兰兔骨质疏松模型成功建立。 瓾：甀口腔颌面修复学杂志；：国骨质疏松杂志；猺， ：

14、 可注射组织工程骨用于骨质疏松种植修复的初步探索骨质疏松是临床上常见的骨代谢疾病，它影响颌骨的质量和数量，对种主要实验试剂与仪器可注射凝胶的应用方式研究 种子细胞为自体。外周血取自耳中动脉，每只兔取血左四撕冰箱保存备用。可注射组织工程骨的构建手术过程为的种植窝。去除近心端部分黄骨髓，尽量止血。 军医进修学院怫十学位论女罕钙尽恕骸紫咚晃J质跚锌诿谩：切开皮肤、肌肉层暴露骨膜。 军医进修学院博士学位论文可注射材料应用方式组实验用兔无死亡。培养结果 军医进恬学院博十学位论文篋囤的两个细胞集落选到融合时相互接触。 军医进售学院博士学位论文空白对照组种植体悬空部分周围无骨组织，与皮质骨交界处有轻度的骨。

15、实验组种植体悬空部分周围有不。空内对照组种植体骨外悬空部分无新生骨蟛成。；对照组种植体骨外悬空部分无新生骨形成。 军暖进恪学院博十学位论文图勺渥橹坦歉纳浦种蔡骞钦系男鄄 军医进修学院博士学位论文可注射材料应用方式 军医进修学院博士学位论文针对垂直型种植体周围骨缺损，修复的方式有两种，一种是在种植体植入前首先进行牙槽骨扩增，确认扩增成功后再植入种植体；一种是在种植体植入的同时，将修复材料应用到种植体悬空部分周围，一起完成牙槽骨扩增术。骨组织工程作为一项新技术，在解决这一问题方面取得了一定进展。大部分临床报道采用了后一种方式，在种植体取得良好初期稳定性的前提下，将修复材料堆积在种植体悬空部分周围，

16、可以收到满意的疗效，缩短了治疗周期。本研究在手术过程中，种植体未全部植入股骨内，在皮质骨表面露出高构建的可注射组织工程骨修复垂直型种植体周围骨缺损的效果。以前研究显示，在利用自体骨进行牙槽骨扩增术时，骨质疏松可以导致 指标下降。种植体植入后，通过该可注射组织工程骨，可以在种植体周围提供大量成骨细胞，无需等待体内间充质干细胞的迁移、分化过程，成骨活动等各项指标。 甋琓， ：瓻 甊：；： 甁：，琣，籰 文 、，两者没有 骨质疏松患者行种植牙治疗时采取的处理措施大改善种植体的骨整合，但是在临床上却面临着更为复杂的情况。激素替代未给患者带来更高的成功率。双膦酸盐的应用虽然能大大减轻骨质疏松的症状，在动

17、物实验中也能有效地提高种植体的骨整合，但是存在着导致颌骨坏死的危斛踔劣斜栏笤谟盟嵫魏螅涸睾个月内功能一直正常的种植体发生失败，这使双膦酸盐的应用价值大大折扣。目前尚无其他抗骨质疏松药物用于骨质疏松状态下种植牙治疗的临床报道。 到了瓶颈：表面涂层技术的进步使很多促进骨形成的生长因子和抗骨质疏松药物能够与涂层材料一起包被到种植体表面，理论上这些生长因子或药物在 篴甌琄郑瑶，周秀青口腔骨丢失与骨质疏松症关系的研究进展现代中西医结瓻 瓸，：甀陈守平，周正炎，陆卫青骨质疏松症对骨内种植体影响的实验研究口， 。删甅 瓹，籰李亚男，刘洪臣，倪紫砚骨质疏松状态下牙种植体骨整合及生长改变的：。 ：，猟琓 ，：籰 瓻 珺： 琍赾琧甴；： ； ：琋 ： 军医进修学院博：卜学位论文 篽；陈宁主编口腔种植技术江苏科学技术出版社南京：珿 组织工程骨修复种植部位骨量不足的临床进展胞来源，提供成骨细胞和内皮细胞以构建血管化组织工程骨【。 另一个好处是随着可注射凝胶的降解，生长因子慢慢释放出来。可以持续的发挥作用。人源性凝血酶是这些研究中的共同选择，凝血酶与纤维蛋白原 组织工程骨在上颌窦底提升术中的