荧光定量PCR技术-讲座

1、实时荧光定量PCR技术的原理、应用及实践,(Real time Quantitative PCR),Real time Quantitative PCR,基 本 原 理,Company name,基本原理,Company name,Real-time qPCR的定义,Company name,实时荧光定量PCR技术： 利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线实现对起始模板的定量分析。,Real-time PCR仪 ABI7500,PCR：基本原理,Denaturation: 94 96C,Annealing: 50 65C,Extension:

2、 70 75C,基本要素： Template Primers DNA polymerase dNTP, N=A,G,C or T,Company name,与普通PCR的比较,S形曲线，具有平台效应,终点检测法,反应效率差异的累积使终点定量几乎不可能,不同浓度的起始模板经PCR扩增后到达某一定值时所需要的循环数来计算起始模板量,定量原理,Company name,理想的PCR反应： X=X0*2n 实际的PCR反应： X=X0 (1+Ex)n n：扩增反应的循环次数 X：第n次循环后的产物量 X0：初始模板量 Ex：扩增效率,定量原理,在扩增产物达到阈值线时: XCt=X0 (1+Ex)Ct

3、=M (1) XCt:荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量. 在阈值线设定以后,它是一个常数,我们设为M 方程式(1)两边同时取对数得: log M=log X0 (1+Ex)Ct (2) 整理方程式(2)得: log X0= - log(1+Ex) Ct+ log M (3) log(1+Ex) Ct=- log X0 + log M Ct=-klogX0+b,Company name,Company name,每个模板的 CT 值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多， CT 值越小。,确定初始模板的浓度,定量原理,Ct=-klogX0+b,real-time qPCR使

4、确定模板初始数量成为可能,11,实时荧光定量PCR中的三个概念,扩增曲线 (primary curve),Company name,Company name,荧光阈值（threshold),是在扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在PCR反应指数扩增阶段任意位置上，但一般荧光域值的缺省设置是PCR反应前3-15个循环荧光信号标准偏差的10倍。,阈值线,原则：1）要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值； 2）同时要尽量选择进入指数期的最初阶段,CT 值(Cycle Threshold),Company name,Ct值的定义： PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的

5、扩增循环次数,Company name,Ct值的特点： 相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定； Ct值则极具重现性,检测方法,Company name,非特异性荧光标记： SYBR Green I 特异性荧光标记： 水解探针： TaqMan 非水解探针：Molecular beacon,17,解析方法,Company name,将温度对荧光强度的变化求导。(-dI/dT),确认PCR反应的特异性,融解曲线分析,Company name,融解曲线分析,Company name,初始模板量的对数与循环数（Ct值）呈线性关系，就可以制作以起始拷贝数的对数为横坐标，Ct值为纵坐标的标准曲线。,标

6、准曲线分析,计算样品的起始拷贝数,已知基因拷贝数的标准品建立标准曲线,关键： DNA的精确定量,绝对定量,22,相对定量,以各自样本中内参基因为标准，比较不同样本中目的基因的相对表达丰度,23,相对定量的数据处理,Ct, Ct,Pfaffl Modification,Vandesompele Method,非均一化的 需要后续的 均一化,以内参基因作为标准 目标样品的相对定量通过内参基因的相对定量进行均一化 只有一个内参基因 假设扩增效率为100%,扩增效率不同 只有一个内参基因,扩增效率不同 多个内参基因,简单,复杂,比较Ct法 2 -Ct Fold induction = 23 = 8,C

7、ompany name,相对定量方法, Ct存在的问题,Company name,成立条件：假设扩增效率为100% 满足条件：1）内参基因和目标基因的扩增效率接近 2）内参基因和目标基因的扩增效率为90%-110%,相对定量方法,实 验 流 程,Company name,应 用,定量 基因表达水平检测 定量 基因拷贝数检测 多色标记 SNP检测 高精度溶解曲线分析（HRM）- SNP 高精度溶解曲线分析（HRM）- DNA甲基化分析,基因表达水平检测,Company name,样本处理,RNA提取,qPCR,数据分析,实 验 流 程,逆转录,样本处理与RNA提取,外界刺激 可检测的表达改变 样

8、品离开定义环境 裂解、固定细胞 Trizon 裂解液 （氰酸胍，异硫氰酸呱， SDS） 液氮 RNA保存液 小心DNA污染！ 使用DNase 以RNA作PCR阴性对照,CW0580,CW0592,逆转录,逆转录引物选择 下游应用：是否检测其它基因？ Abundant RNA的干扰：mRNA or total RNA？ 检测灵敏度是否足够？ 是否会有二级结构干扰？,一步法还是两步法？,两步法： 步骤多但灵活多样。cDNA可长期保留检 测多个基因。便于反应优化。 推荐：工作的初期阶段,RealSYBR 二步法荧光定量PCR试剂盒/With ROX,RealSYBR 一步法荧光定量PCR试剂盒/Wi

9、th ROX,RealSuper 二步法荧光定量PCR试剂盒/With ROX,一步法：简便、快捷但只做一个基因，一旦失败 难以查找原因。 推荐：工作的成熟阶段,RealSuper 一步法荧光定量PCR试剂盒/With ROX,Master mix的优化,Hotstar 化学修饰，低温下酶活抑制强，热复活需10分钟 Fast Hotstar 抗体或oligo修饰，热复活仅需几十秒,CW0696,CW0704,热启动DNA聚合酶,反应条件优化,内参基因 单一特异性产物 反应效率90%-110%,反应条件优化,目的基因 单一特异性产物 反应效率接近内参基因 反应效率尽量高,内参基因,高丰度 ACT

10、B，GAPDH 中等丰度 beta2M 低丰度 HPRT1,36,扩增产物设计原则,总原则与普通PCR相同,二级结构,Company name,扩增产物的二级结构,引物避免位于颈环结构上,Company name,引物的位置,Company name,55,60,65,温度对二级结构的影响,Company name,实 践,Company name,实 践,内参基因的标准曲线的 绘制与数据分析,Company name,样本：293T细胞株 人 提取方法：Trizon RNA 提取试剂,CWBIO 公司 CW0580说明书,2106 个细胞总RNA 琼脂糖凝胶电泳图,RNA提取,Company

11、 name,逆转录：HiFi-MMLV cDNA 第一链合成试剂盒,CWBIO 公司 CW0744说明书,取5ul扩增产物，用1.7%琼脂糖凝胶进行电泳,体系： 2 TaqMasterMix 10ul GAPDHF引物（10um）0.5ul GAPDHR引物（10um）0.5ul cDNA 1u 加入灭菌水至20 ul。,逆转录,Company name,模板,反应体系的配置,cDNA 模板 2.0l 正向引物F(10M) 0.5l 反向引物R (10M ） 0.5l REALSYBR Mixture(2) 10.0l ddH2O 7.0l Total 20.0l,Company name,注意：1、为了避免加样误差，做预混体系 2、充分混匀，如有气泡短暂离心,Company name,95 5min 95 10-15sec 60 20-30sec Plate read Go to 2 for 39 cycles more Melting curve analysis: from 72 to 95, read every 0.2 , hold 1sec between reads End,Tm值：DNA解链一半时的