聚合酶链反应及相关技术

1、第九章 聚合酶链反应及相关技术 上海交通大学 樊绮诗,聚合酶链反应于二十世纪80年代由K.Mullis建立，并和定点突变的发明者M.Smith一起荣获1993年度 诺贝尔化学奖，为生命科学领域的研究开创了崭新时代。,第一节 聚合酶链反应,第二节 以PCR为基础的相关技术,第三节 PCR产物的检测,第一节 聚合酶链反应,聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）是DNA体外复制反应，基本原理与细胞内DNA的复制相似,第一节 聚合酶链反应,第一节 聚合酶链反应,一、PCR反应原理、反应过程和特点,二、PCR的反应体系,三、PCR的反应条件,四、PCR技术的质量控制

2、,一、PCR反应原理和反应过程,1.原理 DNA的体外复制包括3个步骤： 变性（denaturation）: 94C95C 退火（annealing） : 40C70C 延伸（extension） : 72C,变性: DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链分子作为 反应的模板 退火: 引物与模板互补结合，形成杂交链 延伸: 按照模板链的序列以互补的方式依次把dNTP加至引物的3端，Taq DNA聚合酶使杂交双链不断延伸，直至形成新的DNA双链,一、PCR反应原理和反应过程,d.NTPs,耐热DNA聚合酶,引物,退火,加入试管中,一、PCR反应原理和反应过程,循环,一、PCR反应原理和反应过程,第二个

3、循环 4个拷贝,第三个循环 8个拷贝,第n个循环 2n个拷贝,一、PCR反应原理和反应过程,2.特点,特异性强 引物与模板结合的特异性及聚合酶的忠实性 灵敏度高 指数增长，从pg (10-12)可扩增至 mg (10-6)水平 简便、快速 24 小时完成扩增反应,一、PCR反应原理和反应过程,二、PCR的反应体系,参与PCR反应的主要成份:,1.模板,2.引物,3.脱氧核苷三磷酸,4.Taq DNA聚合酶,5.镁离子浓度,6.其它反应因素,1.模板（template）,基因组DNA、RNA、质粒DNA、线粒体DNA等 RNA作为模板时，须先将RNA逆转录为cDNA 模板量：1000ng、500

4、ng、100ng、50ng 反应体系中较低量的模板有利于提高扩增产量和减少非特异性扩增,二、PCR的反应体系,2.引物(primer),化学合成的寡核苷酸 与模板特异地结合 决定产物的特异性和长度,二、PCR的反应体系,设计引物的原则(一),两条引物分别位于被扩增片段的两端，与模板正负链序列互补 长度为1825个核苷酸 二条引物之间避免形成引物二聚体,引物浓度：0.10.2mol/L，浓度过高容易生成引物二聚体,二、PCR的反应体系,设计引物的原则(二),引物的碱基组成应平衡，C+G 碱基含量在引物中的比例一般以45%55%为宜 引物退火温度计算：Tm=2（A+T）+4（C+G） 引物的5端可

5、被修饰（引入酶切位点、引入突变位点、生物素等标记）,二、PCR的反应体系,3.脱氧核苷三磷酸（dNTP）,dATP、dCTP、dGTP和dTTP的混合物 反应体系中各种核苷酸的浓度必须一致 浓度过高虽能加快反应速度，但非特异性扩增也随之增加 最适浓度：20200mol/L,二、PCR的反应体系,4.Taq DNA聚合酶,从一种生活在热泉（8090）中的水栖噬热菌（Thermus aquaticus, Taq）中提取，有很高的耐热稳定性,二、PCR的反应体系,Taq 酶的作用: 在模板指导下，以dNTP为原料，在引物3-OH末端加上脱氧单核苷酸，形成3, 5-磷酸二酯键，使DNA链沿5 3方向延

6、伸，催化DNA合成 最适酶量：12.5U,二、PCR的反应体系,Taq DNA聚合酶无3 5外切酶活性，因而无校正功能，在复制新链的过程中会发生碱基错配 Taq DNA聚合酶在每次循环中产生的移码突变率为1/30000，碱基替换率为1/8000，因此扩增的片段越长，错配的机率越高,二、PCR的反应体系,耐热的高保真 DNA多聚合酶： Pwo DNA polymerase Tth DNA polymerase Pfu DNA polymerase 高热稳定性，高保真性，能降低碱基错配率,二、PCR的反应体系,5.镁离子浓度,对反应系统本身、稳定核苷酸和提高Taq 酶的活性有直接影响 PCR反应体

7、系中dNTP、引物、模板DNA及鳌合剂均可与Mg2+结合，降低游离Mg2+的浓度，影响酶的活性 dNTP浓度为200mol/L时，MgCl2浓度为1.5mmol/L较宜,二、PCR的反应体系,6.其它反应因素,pH：反应所需的最适pH值在7.2左右 盐：合适的盐浓度有利于稳定杂交体，有利于引物与模板杂交 基质：牛血清白蛋白、明胶、Tween20、DTT等,二、PCR的反应体系,三、PCR的反应条件,反应温度（变性、退火、延伸）,2.反应时间（变性、退火、延伸）,3.循环次数（PCR效率及产物量）,4.PCR过程的实时监测,1.反应温度,变性温度：9497 退火温度：低于引物Tm 5左右 温度过

8、高：降低扩增效率 温度过低：增加非特异性扩增 延伸温度：72,三、PCR的反应条件,2.反应时间,第一次变性应给予足够时间 每一个步骤所需时间取决于扩增片段的长度，时间过长易导致非特异性扩增,三、PCR的反应条件,3.循环次数,一般设为2535个循环 每一个循环使一个分子的模板被复制为二个，产物量以指数形式增长,三、PCR的反应条件,一个分子的模板经过30个循环，理论上即可得230(约109)个拷贝产物 实际反应中，每个循环的扩增效率大多约为85%左右,三、PCR的反应条件,扩增反应的平台效应： PCR反应产物呈指数性增长，但这种增长形式在扩增2535个循环以后便放慢直至停止，达到反应平台，此

9、时扩增产物量不再随循环次数的增加而呈指数增长。,三、PCR的反应条件,指数增长期 线形增长期 平台期,循环数,4.PCR实时监测,三、PCR的反应条件,平台出现得迟早与模板的初始量有关，模板初始量越多，平台出现得越早 平台效应产生的因素： 引物二聚体的产生 反应体系各组分的消耗 引物和已扩增的DNA片段间的竞争等,三、PCR的反应条件,四、PCR技术的质量控制,1.实验室的规范化设置 试剂贮存和准备区 标本制备区 扩增反应区 产物分析区,2.防污染体系： 正确设置实验室、严格规范实验操作、完整有效的去污染措施 反应体系中以dUTP取代dTTP，加入尿嘧啶糖苷酶（UNG），破坏以往的扩增产物 每

10、次实验完毕后须用1g/L次氯酸钠清洁实验台面，或用254nm波长的紫外光近距离充分照射,四、PCR技术的质量控制,3.PCR技术的质量保证 基因扩增检验的全过程的质量保证 分析前 分析中 分析后 室内质量控制和室间质量评价,四、PCR技术的质量控制,第二节 以PCR为基础的相关技术,第二节 以PCR为基础的相关技术,一、逆转录PCR,二、定量PCR,三、多重PCR,四、PCR诱导定点突变,五、连接酶链式反应,六、随机扩增多态性DNA,一、逆转录PCR（RT-PCR）,以细胞内总RNA或mRNA为材料进行体外扩增的技术 主要用于克隆 cDNA、合成cDNA探针，检测RNA病毒、分析基因表达等,逆

11、转录合成cDNA所用的引物：,以PCR扩增所需的下游引物作为逆转录反应的引物 以oligo(dT)作为引物 以人工合成的随机序列（六核苷酸混合物）作为引物,一、逆转录PCR（RT-PCR）,一、逆转录PCR,二、定量PCR(quantitative PCR),对DNA或RNA样本的靶序列进行定量分析 主要用于基因表达的分析、病原体核酸的检测等,荧光定量PCR（fluorescence quantitative PCR,FQ-PCR），又称实时PCR(real-time PCR) FQ-PCR通过荧光信号对PCR过程中的产物量进行实时监测，精确计算出PCR的初始模板量,二、定量PCR,荧光信号的

12、检测方法,二、定量PCR,1.DNA结合染料技术,2.水解探针技术,3.杂交探针技术,4.分子信标技术,1.DNA结合染料技术,PCR反应体系中加入SYBR Green I染料，能选择性地掺入至双链DNA分子中，并且产生强烈荧光 PCR过程中，SYBR Green I染料结合到新合成的双链DNA分子中，结合的荧光信号和DNA含量成正比,二、定量PCR,二、定量PCR,优点：成本较低，无须对引物或探针进行特殊的荧光标记，操作亦比较简单 缺点：特异性不够，染料分子会结合到非特异性扩增产生的双链分子和引物二聚体中，使反应体系中的荧光本底较高,二、定量PCR,2.水解探针技术技术,荧光素标记探针 探针

13、的5端和3端分别标记荧光报告基团R和荧光淬灭基团Q 探针完整时R基团与Q基团分别位于探针的二端，Q基团抑制R基团使其不能发射荧光,二、定量PCR,荧光信号检测 PCR过程中，Taq DNA聚合酶沿模板移动，其 53外切核酸酶活性，可逐个水解脱氧核 苷三磷酸，R基团与Q基团随之分离 R基团不再受Q基团的抑制便发射荧光，R基团信 号强弱的程度与PCR反应产物的拷贝数成正比,二、定量PCR,水 解 探 针 技 术,二、定量PCR,二、定量PCR,3.杂交探针技术（hybridization probe）,反应体系需要2条探针 探针A的3端标以荧光素作为荧光染料供体；探针B的5端标以另一种染料，作为荧

14、光染料受体。 2个探针的序列头尾排列，并且相距仅间隔1个碱基，从而能够进行荧光共振能量的转移,二、定量PCR,外来光源首先刺激供体荧光染料，供体便发光刺激附近的受体荧光染料，使后者再发射出具另一种波长的信号而被检测系统接收 受体荧光染料在2个探针都与模板杂交时才会被激发而发射荧光信号,二、定量PCR,分子信标是一段荧光素标记的寡核苷酸 环状区(1530个核苷酸) 柄区(58个碱基对)组成 5末端标记荧光基团 3末端标记淬灭基团,4.分子信标技术（molecular beacon）,二、定量PCR,在自由状态下，分子信标的结构呈发夹状，两端的基团相距较近，荧光基团将能量转移给淬灭基团而使荧光淬灭

15、，荧光本底极低 当分子信标与序列互补的靶分子结合时，分子信标的构型发生变化，柄部被打开，从而使荧光基团远离淬灭基团而发射荧光,二、定量PCR,分子信标技术原理,二、定量PCR,定量 PCR参照系统,二、定量PCR,1.外参照系统的设置,2.内参照系统的设置,1.外参照系统,Ct值(cycle threshold) 扩增曲线与荧光本底基线的交叉点处相应的反应循环数,即每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数 Ct值与模板的起始拷贝数的对数存在线性反比关系，起始拷贝数越多，Ct值越小,二、定量PCR,相同模板进行96次扩增的扩增曲线图,二、定量PCR,利用已知起始拷贝数的标准品作出标准

16、曲线，横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值 获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数,二、定量PCR,2.内参照系统,内标准品:一段人为地引入了突变序列的靶基因片段 内标准品加入被检样品中一起抽提、扩增 内标准品和靶基因的探针分别用2种不同的荧光染料标记，二者探针杂交的序列不同,二、定量PCR,同一对引物同时扩增靶基因和内标准品，双通道荧光检测系统可以特异地同时检测出内标准品和靶基因的扩增产物，计算出靶基因起始拷贝数 内参照系统避免了由于不同抽提效率导致的样本间的差异，使结果的重复性更好，定量更为准确,但仍不能监控内标准品和靶基因是否有一致的扩增效率,二、定量PCR

17、,三、多重PCR(multiplex PCR),在同一反应体系中加入多对引物，同时扩增一份 DNA样本中多个靶片段,四、PCR诱导定点突变,1.引入点突变,A,B,A,B,P2,P1,PCR,用酶A和B消化，将突变位点引入PCR产物,2.引入大片段缺失,四、PCR诱导定点突变,五、连接酶链反应(LCR）,空隙LCR 引物与模板特异性互补 引物A和B之间、a和b之间有一段空隙 空隙在DNA聚合酶的作用下特异性延伸 连接酶连接缺口,六、随机扩增多态性DNA(RAPD),RAPD是一种在整个基因组DNA内进行随机扩增而获得多态性长度DNA片段的技术 用一条随机序列的引物与模板DNA序列作随机配对，反

18、应过程中随机引物只有在与模板DNA互补后，在足够近的间距(2002000bp)内、方向相对的两个引物片段之间的模板DNA序列才能被扩增,六、随机扩增多态性DNA,不同个体DNA序列之间存在差异或发生突变，经扩增所得到的产物片段长度会有所不同，经过电泳分离便可以发现这种差异，从而可了解和比较两个生物体之间基因组DNA的结构等信息,随机扩增多态性DNA,六、随机扩增多态性DNA,RAPD的应用 种群生物学研究 基因组DNA图谱构建 遗传鉴定 临床致病菌的流行病学检测和分型 DNA指纹鉴定,六、随机扩增多态性DNA,第三节 PCR产物的检测,第三节 PCR产物的检测,一、PCR-限制性片段长度多态性

19、（PCR-RFLP）,二、等位基因特异性寡核苷酸（ASO）,三、单链构象多态性（SSCP）,四、变性梯度凝胶电泳（DGGE）,五、融点曲线分析(melting curve analysis),六、PCR产物的序列分析（sequencing）,一、 PCR-限制性片段长度多态性,PCR-RFLP是对PCR产物作限制性片段长度多态性分析 根据PCR产物的突变序列是否位于限制性内切酶的酶切位点内而设计 突变点在某一限制性内切酶的酶切位点序列时，可在突变点的二侧设计引物，或通过改变引物序列使扩增产物产生（或消失）酶切位点,用相应的内切酶对扩增产物进行水解并作电泳分离，PCR产物能（或不能）被酶水解而产

20、生不同长度的片段 根据水解片段的大小和相应电泳位置可区分野生型和突变型靶基因片段,一、 PCR-限制性片段长度多态性,一、 PCR-限制性片段长度多态性,二、等位基因特异性寡核苷酸,用寡核苷酸探针和PCR产物进行杂交检测点突变的技术 被检靶片段经PCR扩增并经电泳分离后转移到膜上，分别与经标记的野生型和突变型靶基因序列的寡核苷酸探针杂交,PCR产物仅与完全互补的探针进行杂交 含突变序列的产物仅与突变探针杂交 根据有无杂交信号判断被检扩增片段中是否带有突变点,二、等位基因特异性寡核苷酸,二、等位基因特异性寡核苷酸,不同顺序 不同构象 不同电泳行为,三、单链构象多态性,单链DNA分子的空间构象，取决