第十二章+酵母基因工程.ppt

1、在第12章酵母基因工程中，1974 Clarck-Walker和Miklos发现了很多酿酒酵母中存在质粒。 1978 Hinnen将来自一个酿酒酵母的leu2基因导入另一个酿酒酵母中，弥补后者的leu2缺陷，显示酵母表达系统在1981 Hitzeman用酿酒酵母中成功表达了人IFN。 1983年我国首次在酵母菌中表达了HBV HBsAg基因。 1996年完成了第一真核生物酿酒酵母的全染色体组测序，而酵母菌作为外源基因表达接纳体的特征，酵母菌(Yeast )是以芽殖或裂殖方式进行无性繁殖的单细胞球真核生物群。 二、酵母菌表达外源基因的优点：全染色体组测序，基因表达调控反应历程明确，遗传操作简便。

2、 具有真核生物蛋白翻译后加工修饰系统。 大规模发酵工艺简单，成本低廉。 不含特异性细小病毒，不产生毒素，被美国FDA认定为安全的基因工程接纳体系统。 可以在培养基中分泌细胞外来基因表达产物。 (1)、不足之处生成物蛋白质不均匀、信号肽加工不完全、内部分解、多聚体形成等幻灯片7、解决内部分解的方法将富含氨基酸和多肽的蛋白质蛋白胨或干酪素水解作用物添加到培养基中，使培养基pH变成酸性，用抑制中性蛋白酶活性的蛋白酶缺陷酵母突变体进行外来基因的表达。 幻灯片5、第二节常用酵母表达系统、一、酿酒酵母表达系统、酿酒酵母中的2环状质粒：RAF、野生型、双链、环状、6kb、拷贝数50-，REP:查询密码产物为

3、质粒稳定性STB: REP 自主复制序列型质粒含有ARS，不稳定，拷贝数高。 整合型质粒不含ARS，必须整合，由于拷贝数低的糖蛋白核心果寡糖链在末端仅含有1、3甘露聚糖，所以酿酒酵母经常制造亚单位疫苗(例如HBV疫苗、口蹄疫疫苗等)。 二、甲醇营养型酵母表达系统的表达运载体中含有一个甲醇酵母酒精氧化酶催化剂基因(A0 x1 )，甲醇作为衍生物是不适合食品等蛋白生产的巴斯德毕赤酵母生产压电石英药用重组蛋白质，毕赤酵母表达系统的特征是特有的强AOX (酒精氧化酶基因) 含有启动子，可通过甲醇严格控制外源基因表达水平的发酵过程成熟、易于扩展。 培养成本低，生成物容易分离。 外源蛋白基因遗传稳定。 作

4、为真核表达的系统，毕赤酵母具有真核生物的亚细胞结构，并具有糖基化、脂肪酰化、蛋白磷酸化等翻译后修饰加工功能。 三、裂殖酵母(Schizogenesis pombe )表达系统外源基因产物具有相应的天然蛋白质结构和活性。 研究很少。 四、酵母菌的转化方法、原生质体转化法碱金属络离子介导转化法电击转化法、原生质体转化法、Ca2和PEG存在下，转化子可达原生质体总数的1-2%。 线型和环状DNA的吸收没有专一性。 一个接纳体细胞球可以在云同步中容纳多个质粒分子，该共同感受态的原生质体占感受态子总数的25-33%； 原生质体转化法的缺点：转化率受到原生质体再生率的严重制约。操作循环长；2 )碱金属络离

5、子介导感受态法、酵母菌完全细胞球经碱金属络离子(例如Li )、PEG、热休克处理后，可有效吸收质粒DNA。 吸收线性DNA的能力明显大于环状DNA，两者相差80倍。 共变换现象极少见，3 )电击变换法，适用范围广。 酵母菌的完全细胞球或原生质体可在电击下吸收质粒DNA。转化率高达105/g DNA，操作方便五，用于筛选感受态子的标识牌基因，营养缺陷型互补基因显性基因，宿主菌：氨基酸或核苷酸生物合成缺陷型突然变异，如LEU-、TRP-、HIS-、URA-、营养缺陷型互补基因， 运载体：具有相应合成基因的选择性压力力： YNB，无机盐培养基，查询密码产物主要是毒性物质抗逆性蛋白，显性标识牌基因，6

6、，用酵母菌表达外源基因的台阶爱沙尼亚克朗重组酶催化剂切线性感受态筛选筛选转化子小规模诱导鉴定表达量的大规模培养和制备，7， 酵母表面展示系统将外源靶蛋白基因排列与特定运载体基因排列融合后导入酵母细胞球幻灯片26，其锚固件区域与细胞球蛋白质的末端共价键相连，为蛋白质和胞质膜提供稳定的结合。 锚固件蛋白的末端含有疏水性多肽，细胞球蛋白合成后，前驱物蛋白通过羧基化学基末端的疏水性排列锚固件内质网膜，而该佝偻蛋白位于内质网的内腔中。 在极短的时间内，疏水序列被转氨基酶催化剂撕裂部位，置换为云同步锚固件，然后蛋白质转送到高尔基体膜，通过分泌细胞途径分泌细胞于胞质膜外。 利用蛋白水解作用酶催化剂切除分泌细胞信号序列，从胞质膜中释放细胞球蛋白，以锚固件形式输送到与葡聚糖共价键细胞贴壁外。 幻灯片24、凝