维生素的测定.ppt

1、8 维生素的测定,维生素是维持人体正常生命活动所必需的一类天然有机化合物。其种类很多，目前已确认的有30余种，其中被认为对维持人体健康和促进发育至关重要的有20余种。这些维生素结构复杂，理化性质及生理功能各异，有的属于醇类，有的属于胺类，有的属于酯类，还有的属于酚或醌类化台物。,维生素都具有以下共同特点： 这些化合物或其前体化合物都在天然食物中存在；它们不能供给机体热能。也不是构成组织的基本原料，主要功用是通过作为辅酶的成份调节代谢过程，需要量极小；它们一般在体内不能合成，或合成量不能满足生理需要，必须经常从食物中摄取；长期缺乏任何一种维生素都会导致相应的疾病。,我们在评价食品的营养价值，开发

2、利用高含量维生素的食品资源，指导人们合理调整膳食结构，指导制定加工工艺或贮存条件，最大限量地保留各种维生素，还要控制强化食品中加入量，防中毒，都离不开分析检测工作。 维生素分类：脂溶性（A、D、E、K） 水溶性两类（B族、C）,一、 脂溶性V的测定,VA、VD、VE与类脂物一起存于食物中，摄食时可吸收，可在体内积贮。 脂溶性维生素具有以下理化性质： 1溶解性：脂溶性维生素不溶于水，易溶于脂肪、乙醇、丙酮、氯仿、乙醚、苯等有机溶剂。 2耐酸碱性：维生素A、D对酸不稳定， 对碱稳定，维生素E对碱不稳定，但在抗氧化剂存在下或惰性气体保护下，也能经受碱的煮沸。,3耐热性、耐氧化性： 耐热性 氧化性 V

3、A 好，能经受煮沸 易被氧化 （光、热促进其氧化） V D 好，能经受煮沸 不易被氧化 V E 好，能经受煮沸 在空气中能慢慢被化 （光、热、碱促进其氧化）,根据上述性质测定脂溶性维生素时，通常： 皂化样品 水洗去除类脂物 有机溶剂提取脂溶性维生素(不皂化物) 浓缩 溶于适当的溶剂 测定。 在皂化和浓缩时，为防止维生素的氧化分解，常加入抗氧化剂(如焦性没食子酸、维生素C等)。 对于A、D、E共存的样品，或杂质含量高的样品，在皂化提取后，还需进行层析分离。,一、维生素A的测定 维生素A存在于动物性脂肪中，主要来源于肝脏、鱼干油、蛋类、乳类等动物性食品中。植物性食品中不合VA，但在深色果蔬中含有胡

4、萝卜素，它在人体内可转变为VA，故称为VA原。,高效液相色谱法测定食物中VA、VC （GB 5009.822016中第一法） 高效液相色谱法测定维生素A是近几年发展起来的方法，此法能快速分离和测定视黄醇和它的同分异构体、酯及其衍生物。,三氯化锑光度法测定VA的含量 （一） 原理 在氯仿溶液中，维生素A与三氯化锑可相互作用，生成蓝色可溶性配合物，其颜色深浅与溶液中所含维生素A的含量成正比。该物质在620nm波长处有最大吸收峰，其吸光度与维生素A的含量在一定的范围内成正比，故可比色测定。,（二）适用范围及特点 本法适用于维生素A含量较高的各种样品(高于 510 g g )，对低含量样品，因受其他脂

5、溶性物质的干扰不易比色测定. 该法的主要缺点是生成的蓝色络合物的稳定性差。比色测定必须在 ，否则蓝色会迅速消退，将造成极大误差。,6秒钟内完成,（三）注意： 1. 维生素A见光易分解，整个实验应在暗处进行，防止阳光照射，或采用棕色玻璃避光。 2. 三氯化锑腐蚀性强，不能沾在手上，三氯化锑遇水生成白色沉淀因此用过的仪器要先用稀盐酸浸泡后再清洗。 3.乙醚为溶剂的萃取体系，易发生乳化现象。在提取、洗涤操作中，不要用力过猛，若发生乳化，可加几滴乙醇破乳。,4. 由于三氯化锑与维生素A所产生的蓝色物质很不稳定，通常生成6S后便开始褪色，因此要求反应在比色管中进行，产生蓝色后立即读取吸光度。 5. 如果

6、样品中含-胡萝卜素（如奶粉、禽蛋等食品）干扰测定，可将浓缩蒸干的样品用正己烷溶解，以氧化铝为吸附剂，丙酮、乙烷混合液为洗脱剂进行柱层析。 6. 比色法除用三氯化锑做显色剂外，还可用三氟乙酸、三氯乙酸做显色剂。其中三氟乙酸没有遇水发生沉淀而使溶液混浊的缺点。,二、胡萝卜素的测定,胡萝卜素是一种广泛存在于有色蔬菜和水果中的天然色素，有多种异构体和衍生物，总称为类胡萝卜素，其中在分子结构中含有 一紫罗宁残基的类胡萝卜素，在人体内可转变为维生素A，故称为维生素A原。如、胡萝卜素，其中以胡萝卜素效价最高。,胡萝卜素原只存在于植物性食品中，但以含有胡萝卜为食物的家禽、兽类、水产动物及其加工产品，以及为着色

7、而添加胡萝卜素的食品，当然也含有胡萝卜素。,胡萝卜素的结构如下：,胡萝卜素对热及酸、碱比较稳定，但紫外线和空气中的氧可促进其氧化破坏。因系脂溶性维生素，故可用有机溶剂从食物中提取。 胡萝卜素本身是一种色素，在450 nm 波长处有最大吸收，故只要能完全分离，便可定性和定量。但在植物体内，胡萝卜素经常与叶绿素、叶黄素等共存，在提取 一胡萝卜素时，这些色素也能被有机溶剂提取，因此在测定前，必须将胡萝卜素与其它色素分开。常用的方法有纸层析、柱层析和薄层层析法。,纸层析法 1.原理 以丙酮和石油醚提取食物中的胡萝卜素及其他植物色素。以石油醚为展开剂进行纸色谱，胡萝卜素极性最小，移动速度最快，从而与其他

8、色素分离。剪下含胡萝卜素的区带，洗脱后于450nm波长下定量测定。,说明及注意事项 （1）此法所测结果为总胡萝卜素含量，在食品中以-胡萝卜素的含量比例最高，只有少数食品如胡萝卜、紫菜等含有-胡萝卜素和-胡萝卜素。因此一般测定的胡萝卜素仅指-胡萝卜素。 （2）胡萝卜素易被阳光破坏，应在较暗的环境下操作。,三、维生素D的测定,维生素D是指含有抗佝偻病活性的一类物质，具有维生素D活性的化合物约有l 0种，其中最重要的是维生素D2、维生素D 3及其维生素D原。维生素D 2无天然存在，维生素D2只存在于某些动物性食物中。但它们都可由维生素D原(麦角固醇和7一脱氢胆固醇)经紫外线照射形成。 维生素D2 药

9、片吃多了中毒。,维生素D的测定三氯化锑比色法（AOAC法）,1原理 维生素D与三氯化锑在三氯甲烷中产生橙黄色化合物，并在500nm波长处有之大吸收，呈色强度与维生素D的含量成正比。加入乙酰氯可以消除温度、湿度等干扰因素的影响。维生素A和D共存时，须先用柱层析分离，去除维生素A，再比色测定。 2试剂 3操作步骤 （1）样品处理 分离柱的制备。如图所示。 纯化。,图 层析装置,（2）测定 标准曲线的绘制。 样品测定。 4结果计算 式中 x样品中维生素D的含量，mg100g； c标准曲线上查得样品溶液中维生素D的含量，gmL；(如按国际单位，每国际单位0.025g维生素D)； V样品提取后用三氯甲烷

10、定容之体积，mL； m样品质量。,5说明及注意事项 （1）食品中维生素D的含量一般很低，而维生素A、维生素E、胆固醇、速甾醇等成分的含量往往都大大超过维生素D、严重干扰维生素D的测定，因此测定前必须经柱层析除去这些干扰成分。 （2）操作时加入乙酰氯可以消除温度的影响，可使灵敏度比仅用三氯化锑提高约3倍，并可减少部分甾醇的干忧。 （3）此法不能区分维生素D2和维生素D3，测定值是两者的总量。,四、维生素E的测定比色法 1原理 维生素E能将高铁离子还原为低铁离子，低铁离子与，-联氮苯发生颜色反应，可以进行比色测定。 2试剂 3操作步骤 （1）样品处理 皂化；纯化。 （2）样品测定 （3）标准曲线的

11、绘制 4计算结果 同维生素A的测定。1国际单位维生素E相当于1.1mg-维生素E。,5说明及注意事项 （1）在皂化时，用氮气流保护，也可加入焦性没食子酸作为抗氧化剂，防止维生素E的氧化。 （2）此法反应没有特异性，故处理前应将其他还原性物质除去。 （3）也可采用4，7-二苯基-1，10-菲绕啉作为发色剂，其灵敏度比，-联吡啶高2.4倍。 （4）维生素E的各种异构体与试剂的反应速度、呈色强度各不相同。 （5）由于光能促进维生素E氧化，因此尽可能避光操作。,二、 水溶性维生素的测定,水溶性维生素B1、B2和C，广泛存在于动植物组织中，饮食来源充足。但是由于它们本身的水溶性质，除满足人体生理、生化作

12、用外，任何多余量都会从小便中排出。为避免耗尽，需要经常地由饮食来提供。,水溶性维生素都易溶于水，而不溶于苯、乙醚、氯仿等大多数有机溶剂。在酸性介质中很稳定，既使加热也不破坏；但在碱性介质中不稳定，易于分解，特别在碱性条件下加热，可大部或全部破坏。它们易受空气、光、热、酶、金属离子等的影响； 维生素B2对光，特别是紫外线敏感，易被光 线破坏； 维生素C对氧、铜离子敏感，易被氧化。,根据上述性质，测定水溶性维生素时，一般都在酸性溶液中进行前处理。,维生素Bl、B2 盐酸水解 酶解 提取 纯化 维生素C通常采用草酸、草酸醋酸、偏磷酸醋酸溶液直接提取。在一定浓度的酸性介质中，可以消除某些还原性杂质对维

13、生素C的破坏作用。,（一）维生素Bl的测定,维生素Bl又名硫胺素、抗神经炎素，通常以游离态，或以焦磷酸酯形式存在于自然界。在酵母、米糠、麦胚、花生、黄豆以及绿色蔬菜和牛乳、蛋黄中含量较为丰富。 分析方法：GB 5009.84-2016中的方法是高效液相色谱法和荧光法。,说明及注意事项 （1）凡士林具有荧光，涂在活塞上会带来污染，可用甘油-淀粉润滑剂代替凡士林。 （2）一般样品中的维生素有游离型的，也有结合型的，故需要用酸和酶水解，使结合型化为游离型的，然后再用本法测定。 （3）谷类物质不需酶分解，样品粉碎后用酸性KCl直接提取、氧化测定。 （4）淀粉酶不需要配成溶液，以免因保存时间长而失去活力

14、。 （5）铁氰化钾的用量要适当，过多会破坏硫胺素，过少则硫胺素氧化不完全。 （6）氧化是操作的关键步骤，操作中应保持加试剂的速度一致。,（二）维生素B2的测定,维生素B2即核黄素。在食品中以游离形式或磷酸酯等结合形式存在。膳食中的主要来源是各种动物性食品，其中以肝、肾、心、蛋、奶含量最多，其次是植物性食品的豆类和新鲜绿叶蔬菜。 分析方法： GB 5009.85-2016中 第一法为高效液相色谱法。 第二法为荧光分光光度法。,直接荧光法（低二硫酸钠荧光法） 原理 核黄素在440500nm波长光照射下产生黄绿色荧光。在稀溶液中其荧光强度与核黄素的浓度成正比，在波长525nm下测定其荧光强度。试液加

15、入连二硫酸钠，将核黄素还原为无荧光的物质，然后再测定试液中残余荧光物质的荧光强度，两者之差即为食品中核黄素所产生的荧光强度。色素干扰可用高锰酸钾氧化除去。,说明及注意事项 本法适用于粮食、蔬菜、调料、饮料等脂肪含量少的样品，脂肪含量过高及含量较多不易除去色素的样品不适用。 酶解的目的是为了使结合型的维生素B2转化为游离型的维生素B2。 核黄素对光敏感，因此操作应尽可能在暗室进行。,（三） 维生素C（抗坏血酸）的测定,维生素C是一种己糖醛基酸，有抗坏血病的作用，所以又称作抗坏血酸。新鲜的水果蔬菜，特别是枣、辣椒、苦瓜、猕猴桃、柑橘等食品中含量尤为丰富。 测定维生素C常用的方法有靛酚滴定法、苯肼比

16、色法、荧光法和高效液相色谱法等。,（1）2，6-二氯靛酚滴定法,1原理 还原型抗坏血酸可以还原染料2，6-二氯靛酚。该染料在酸性溶液中呈粉红色(在中性或碱性溶液中呈蓝色)，被还原后颜色消失。还原型抗坏血酸还原染料后，本身被氧化成脱氢抗坏血酸。在没有杂质干扰时，一定量的样品提取液还原标准染料液的量，与样品中抗坏血酸含量成正比。,2. 说明, 所有试剂最好用重蒸馏水配制。 样品采取后，应浸泡在已知量的2%草酸溶液中，以防止维生素C氧化损失。测定时整个操作过程要迅速，防止抗坏血酸被氧化。 若测动物性样品，须用10%三氯乙酸代替2%草酸溶液提取。 若样品滤液颜色较深，影响滴定终点观察，可加入白陶土再过滤。白陶土使用前应测定回收率。 若样品中含有Fe2+、Cu2+、Sn2+、亚硫酸盐、硫代硫酸盐等还原性杂质时，会使结果偏高。,(三)荧光法 GB 5009.86-2016 第二法 1.原理 样品中还原型抗坏血酸经活性炭氧化成脱氢型抗坏血酸后，与邻苯二胺（OPDA）反应生成具有荧光的喹喔啉，其荧光强度与脱氢抗坏血酸的浓度在一定条件下成正比，以此测定食物中抗坏血酸和脱氢抗坏血酸的总量。 脱氢抗坏血酸与硼酸可形成复合物而不与OPDA反应，以此排除样品中荧光杂质所产生的干扰。 本方法的最小检出限为0.022g/m