那他霉素发酵工艺的研究(本科毕业)

1、那霉素发酵工艺研究摘要：牙齿实验以钠霉素为菌种进行了一系列发酵，通过其单因素实验和正交实验确定了最佳培养基配方和发酵条件：葡萄糖3.5%，大豆蛋白1.85%，酶粉0.40%，初始pH值7.0，接种3%，50毫升。结果在牙齿配方和发酵条件下，纳他霉素产量可达1.2g/L。关键词：纳他霉素培养基的发酵最优化前言纳他霉素也称为链霉素，是天然聚烯烃类抗生素1。纳塔尔链霉素牙齿发酵的次代谢产物，有效抑制酵母菌和丝霉菌的生长和真菌毒素的产生，被广泛用于食品防腐和真菌引起的疾病治疗2。目前国际许可的生物防腐剂只有乳酸链球菌素、纳他霉素、聚赖氨酸三种茄子3。我国目前允许的只有乳酸链球菌素和纳他霉素。钠霉素是一

2、种新型防腐剂，具有高效杀菌效果和无毒无害的安全保障，各行业都偏爱4。近年来，随着世界经济的快速发展，人们的生活水平全面提高，对无毒无害食品的偏好越来越高，各行业开始寻找这种防腐剂。钠庆大霉素的高效杀菌效果和无毒无害安全，导致庆大霉素钠诞生。目前有30多个国家使用庆大霉素钠作为天然食品添加剂和防腐剂。1材料和方法1.1材料1.1.1株生产菌株：棕色黄浦链菌S. S.giLvosPoreus，ATCC13326。1.1.2主要药物无水葡萄糖分析纯上海生物工程有限公司麦芽粉RT天津化学试剂厂琼脂粉末生化试剂5化学股份有限公司牛肉蛋白胨微生物培养基北京化学试剂公司大豆蛋白胨生化试剂北京海淀区微生物培养

3、基产品厂酵母浸出粉生化试剂成都彭县立春化工厂糊精分析纯北京海淀区微生物培养基产品厂水溶性淀粉分析纯天津市化学试剂批发部流通麦芽糖生化试剂天津化学试剂厂蔗糖分析纯天津化学试剂批发部教练氯化钠分析纯天津化学试剂厂MgSO4分析纯天津市塘沽化学试剂厂HCl分析纯天津化学试剂部教练磷酸分析纯天津化学试剂三厂1.1.3主要装置LDS 10离心机上海安廷科学仪器厂TGL 16B高速台式离心机北京医用离心机厂电热恒温培养箱湖北省黄石市医疗器械厂。DFG801传记鼓风机天津实验设备厂HKCB-1-3恒控磁搅拌器gransie电子分析天平瑞士超纯北京通用仪器有限责任公司微波炉温州市医疗电气厂初顺工作台烧酒净化设

4、备厂。1.1.4培养基活化液体培养基(g/L):葡萄糖15g蛋白5g麦芽浸液8g酵母粉7g PH7.0斜面保存培养基(g/L):葡萄糖15g酵母粉4g蛋白5克琼脂粉10g麦芽浸液2g PH7。o分离培养基(g/L) :葡萄糖20g蛋白5g酵母粉3g麦芽浸液2g琼脂粉末10g PH7.0种子培养基(g/L):葡萄糖20g蛋白6克酵母粉4克NaCl8克PH 7.0发酵培养基(G数):大豆分离蛋白20g酵母粉3g PH 7.0葡萄糖(50%葡萄糖单独杀菌)7克胃培养基灭菌条件：115，灭菌30min1.2测试方法1.2.1菌株的激活在锥虫病中接种含有10毫升液体的活性培养基，接种于25毫升的三角病，

5、在25，300/min振动下培养48h，在保存坡度后培养25恒温下培养120h，在斜坡几乎完全被孢子复盖的情况下，放入冰箱(4)准备1.2.2菌株的分离将0.3ml孢子悬浮液接种到含有20ml培养基的板上，涂5个板，用25C恒温培养120 h。然后，根据群落的形态、大小等，选择具有不同典型形态的单菌，用D=10毫米的冲床打10个孔，将单菌洛川阵地放在D=100毫米的培养皿中，在25 的恒温下培养板24h，如果边缘出现明显的抑制菌圈，用抗生素逆家系测定抑菌圈的大小。选择菌圈较大的菌群，移至保存坡，用25恒温培养120h。1.2.3种子培养在包含50毫升种子培养基的250毫升三角瓶中吸收5毫升孢子

6、悬浮液，通过25C，300 r/min振动培养48h，使菌体快速到达生长期。1.2.4奶昔烧瓶发酵培养以3%的接种量接种种子液，用含50毫升液量的250毫升三角瓶，25C，300 r/min旋转摇针发酵120 h。1.2.5生产细菌的测定-干重量法6首先将滤纸放在100C烤箱下，烘烤到恒重，称重并记录数据，然后放入布氏漏斗。取10ml发酵液，3000r/min离心30min，倒入上面的清液，收集沉淀物，用无菌水清洗两次，将洗好的沉淀物冲洗到布氏漏斗中，将滤纸和菌体从50C烤箱干燥到恒重，测量和计算菌体的干重。2结果和讨论2.1徽章最优化2.1.1种子培养基的最优化表1种子徽章(g/100ml)

7、种子培养基1#2#3#增长状态比较差通常最好的如上表所示，#3种子培养基配方提高了种子液的菌丝浓度，使生长状态更好。因此，种子培养基为：淀粉1.0%，酪蛋白陈0.6%，玉米果肉0.6%，葡萄糖1.0%，豆粉1.0%，七水硫酸镁0.1%，磷酸二氢钾0.05%，碳酸钙0.5%，氯化钠0.2%2.1.2倾斜徽章的最优化倾斜培养基的优化主要考察了碳源、氮源等因素对纳他霉素产生菌生长的影响。早期倾斜培养基配方为：葡萄糖1.0%，酵母提取物为0.3%，麦芽提取物为1.0%，琼脂为0.5%，pH7.0。在牙齿培养基上培养时，发现菌落不够厚，孢子量也比较小，为了得到更多的孢子，设计下一个6茄子斜面培养基进行实

8、验最合理。表2倾斜徽章(g/100ml)培养基1#2#3#4#5#6#增长状态几乎没有几乎没有生长生长比较好更深更好在上表中，添加可溶性淀粉和黄豆粉的斜面培养基中孢子的生长情况明显好转，6#配方的培养基中孢子生长情况最好，因此最终确定的培养基配方为3360淀粉1.0%，葡萄糖1.0%，豆粉1.0%，酵母提取物0.3%，麦芽提取物0.3%。斜面放在25 的生化培养箱里培养5天。2.2发酵条件的最优化2.2.1疫苗接种对发酵结果的影响图3早期接种对庆大霉素钠生产的影响上图显示，接种量从3%增加到12%时，纳他霉素产量也急剧增加，接种量为12%的产量是接种量为2%时的4倍。此后，如果继续增加菌种的接

9、种量，纳他霉素产量反而迅速减少。菌种接种量为20%时，纳他霉素的产量下降了近60%。接种量为3% 12%时，菌体干重量的变化不大，保持约30.0g/L。但是随着接种量的增加，菌体的干重反而减少到了20.0g/L。从上面的图表中还可以看出，随着接种量的增加，糖的利用率先增加，然后减少的变化。接种量为12%时，糖的利用率最高，超过90%。溶解氧对2.2.2发酵的影响图4溶解氧对nasodium mycin产量的影响如上第一张图所示，对负载量的杨怡产物合成有很大影响，负载量从10毫升增加到30毫升，纳他霉素的产量增加了近70.2%。此时，如果继续增加液体装载量，纳他霉素的产量反而开始减少。液体量为5

10、0毫升时，纳他霉素产量达到了最小值。假丝菌剂(cnaddiin)、白肉新菌(cnadihxeni)、肉毒杆菌(cnadicidin)等多烯环内酷类抗生素的生物合成都对氧浓度敏感。装载量为10-30毫升时，装载量对菌体生长影响不大。菌间干量约为35g/L，但如果装载量增加到50mL，菌间干重量反而下降到最小值20g/L。如上图所示，糖的利用率表现为随着装载量的增加(即随着溶解氧浓度的减少)先增加，然后减少的现象。装载量为30毫升，消费率接近100%，装载量为50毫升，消费率只有50%左右。这可能是由于液体量太大，溶解氧浓度迅速下降的原因。据调查，发酵液的溶解氧浓度下降到临界氧浓度以下，糖代谢会受

11、到明显影响。如第二张图所示，YP/X和YP/S都是随着装载量的增加而首先增加，然后减少的变化趋势。装载量为25mL时，YP/X和YP/S分别达到了1.98%和0.067%的最大值。但是此后，如果继续增加装载量，都开始明显下降，如果装载量为35ml-55ml，YP/X和YP/S没有太大变化，分别达到了0.671%和0.235%。2.2.3发酵温度对发酵温度的影响图5温度对钠霉素生产的影响在上面的第一张图中，可以看到温度对纳他霉素合成的影响比对菌体生长的影响更明显，有最合适的合成温度和最合适的生长温度。在适当的范围内，温度越低，纳他霉素的产量越高，20C到最高1.0 g/L。温度从20上升到25，

12、菌体干重量比最初增加了20.2%，这可能是由于温度上升，与菌体生长相关的酶加快了反应速度。但是温度太高，酶的停用速度加快了。因此，在25130范围内，菌体的干重开始下降。糖利用率在20C，25C时均保持在80%以上，但随后温度升高，明显减少。温度上升到30，达到最小值，为34.5%。如第二个图中所示，如果温度为28-34C，则YP/X和YP/S会随着温度的降低而略有增加，但是如果温度下降到25C，则YP/X和YP/S会快速增加，达到最高3.816%。2.2.4发酵培养基中碳源对发酵的影响表6早期碳源对庆大霉素钠生产的影响纳他霉素是典型的微生物次代斯产物，次代谢有两个茄子生理阶段，即菌体生长阶段

13、和代谢产物合成阶段7。在菌体生长阶段快速使用的碳源(如葡萄糖等)的分解产物，阻止了二次代谢酶系的合成，只有在这些限制因素耗尽或消耗一定量时，抑制作用才会解除。菌体从生长阶段转移到次代谢产物合成阶段8。如上图所示，葡萄糖是可以快速利用的碳源，是菌体生长良好的碳源和能源。但是如果早期葡萄糖浓度过高，就会产生分解代谢抑制作用，促进大量合成菌丝体代谢，最终抑制二次代谢产物的合成，反而显着降低纳他霉素产量。但是另一边的碳源浓度太低，缺乏菌体生长所需的能量供应，就不能产生足够的纳他霉素的菌体，最终影响抗生素的生产。实验表明，最合适的早期葡萄糖浓度选择为2%。2.2.5发酵培养中ph值对发酵的影响通过将发酵

14、培养基调整为酸碱性，将初始PH值分别调整为3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，11.0，研究培养基的酸性对产生链霉素的影响，从A图表中可以看出，最适合合成产物的pH值是pH的发酵过程中菌体对糖的利用在发酵液的初始pH中性和碱性条件下高达90%左右。但是，当初始pH值为酸性条件时，糖的利用率低于70%。如b图表所示，YP/X和YP/S在初始pH为7.0时达到最高0.35%，在初始pH为6.0时达到最高0.056%。所以最适合纳他霉素发酵的初始pH值为6.0-8.0。图7早期ph值对纳他霉素生产的影响a图b图形2.2.6正交试验确定最佳饮酒过程发酵培养基的各成分之间必须有内在的关系，发酵条件之间也可能徐璐影响，因此各种最佳单因素的组合不一定能达到最佳发酵结果，必须利用正交试验设计正交表，进行科学分析。因此，在实验的各要素之间均衡调配，最终得到最佳的发酵工艺。牙齿实验以单因素实验结果为基础，分别选择总氮、发酵液初始pH值、溶解氧作为考察因素，分别选择3级、L9(34)正交表，以抑菌圈直径的大小测量实验结果的好坏。表8发酵正式最优化方差分析检查结果表明，发酵培养基的初始总氮最强，发酵培养基的初始pH值和溶解氧都