代谢控制发酵的基本思想.ppt

1、代谢控制发酵,Chapter 5 代谢控制发酵的基本思想 （微生物代谢的人工控制）,微生物在正常情况下，通过细胞内自我调节，维持各个代谢途径的相互协调，使其代谢产物既不少又不会过多的积累，而人类利用微生物进行发酵则需要微生物积累较多的代谢产物，为此对微生物的代谢必须进行人工控制 。 人工控制微生物代谢的方法主要有两种： 一、改变微生物的遗传特征 二、控制发酵条件,第一节 微生物生物合成途径的遗传控制,图3-1谷氨酸棒杆菌鸟氨酸生物合成途径 乙酰谷氨酸合成酶 乙酰谷氨酸激酶 NO乙酰谷氨酸醛脱氢酶 乙酰鸟氨酸转氨酶 NO乙酰谷氨酸O乙酰鸟氨酸乙酰基转移酶 鸟氨酸氨甲酰基转移酶 精氨琥珀酸合成酶

2、精氨琥珀酸酶,Arg对N-乙酰谷氨酸合成酶和N-乙酰谷氨酸激酶有反馈调节作用。当选育瓜氨酸缺陷突变株 （ Cit- ），亚适量添加瓜氨酸（ Cit ），就会积累大量的鸟氨酸 。,2、分支途径,（1）,例如：谷氨酸棒杆菌 、产氨短杆菌、黄色短杆菌的选育高丝氨酸脱氢酶缺陷型（hom-）来积累大量Lys。,二、选育抗反馈调节突变株,所谓抗反馈调节突变株就是已解除了反馈调节作用的突变株 。在这些突变株中，因为反馈抑制或阻遏，或两者引起的自动调节作用已被削弱或解除，所以能合成较多的最终产物。,（一）选育抗代谢类似物的突变株（Analogue Resistance Mutant）,通常微生物生长需要各种代

3、谢物。如维生素、嘌呤、氨基酸等。在正常情况下，代谢终产物如氨基酸A过量存在时，就会抑制或阻遏它自身生物合成酶。同时也能整合到蛋白质中去。只有当氨基酸A 浓度足够高时，A与调节酶的调节部位或调节基因编码的阻遏蛋白结合，产生反馈抑制或阻遏作用。当细胞中的A参与蛋白质合成，而使细胞中A的浓度下降到一定程度时，A就会从调节酶的调节部位或阻遏蛋白上脱落下来，从而解除反馈调节，又重新可以合成新的A。当A的浓度再次上升到一定值时，反馈调节再次发生.。,我们说代谢物和调节酶的变构部位或阻遏蛋白的结合是可逆的。而代谢类似物，结构类似物，即A则不同，在培养基中添加A其空间结构与A相似。当细胞中大量存在A时，它也能

4、和A一样与调节酶的调节部位或调节基因编码的阻遏蛋白结合，发生反馈抑制与阻遏作用。由于A不能整合到蛋白质分子中去，细胞中的A浓度不会自行下降。只要A结合到调节酶的调节部位或阻遏蛋白上就不能脱落下来，这种结合是不可逆的。这样也就没有A的生物合成，氨基酸缺乏的细胞会因饥饿而死亡。因此代谢结构类似物对微生物细胞来说是有毒的，只要有结构类似物存在，菌种不会存活。,若我们通过诱导等手段获得突变株，已解除了终产物对酶的反馈调节，也就是说终产物 A不再与调节酶的调节部位或阻遏蛋白结合。那么A的结构类似物A也同样不再与调节酶的调节部位或胞质阻遏蛋白结合，也就是A对菌株的毒害作用表现不出来，我们就说该菌株对A有抗

5、性。（resistance）我们常常将经过各种手段诱变的突变株放到含有终产物结构类似物A的培养基上，挑出长出来的抗性菌株。若突变株抗A性能越强（在含高浓度A上长出来），则说明该菌株解除A对其生物合成系统的反馈调节就越彻底，那么A积累就越多。,根据上述原理，只要选取结构类似物抗性突变株，就有可能得到解除反馈抑制或阻遏的突变株。在这个意义上结构类似物抗性可以作为解除反馈调节菌株的“筛子”。 除了氨基酸外还有嘌呤、嘧啶、维生素等的结构类似物。通过选育这些结构类似物菌株 ，已获得氨基酸、核苷酸、核苷、维生素等各种代谢产物的高产菌株。,（二）从营养缺陷型回复突变株中获得对途径中调节酶解除反馈抑制的突变株

6、,调节酶的变构特性是由它的结构基因决定的，若调节酶因编码它的基因发生突变而失活，则有两种可能： 1、是编码为催化亚基与调节亚基的基因发生了变化。 2、仅仅是编码催化亚基（或活性部位）的基因发生变化。,若通过再次突变，使调节酶的活性恢复，这时又有两种可能： 一是催化亚基和调节亚基恢复（或大体恢复）到第一次突变前那样的状态。另一种是催化亚基得到恢复，而调节亚基却丧失了调节作用，这情况实质上是编码调节亚基的DNA突变，解除了反馈抑制作用。 调节酶的失活与否，可能直接表现为某种营养缺陷型。可以采用营养缺陷型的回复突变的方法，从营养缺陷型回复突变株中获得对途径中的调节酶解除反馈调节的调节突变株。,三、产

7、物降解酶缺失突变株,为了使产物在发酵液中稳定地存在，以提高发酵单位，可通过诱变获得缺乏降解产物酶的突变株，其方法是诱变处理后，如图所示：,四、增加前体物的合成,通过选育某些营养缺陷型或结构类似物抗性突变株以及克隆某些关键酶的方法，增加目的产物的前体合成，有利于目的产物的大量积累。,五、细胞膜组分缺失突变株,第二节 生物发酵条件的控制（外因）,当菌株选育确定后，环境条件合适与否是发酵成败的重要因素。环境条件既影响微生物生长，又影响代谢速度和方向及产物形成与积累。现以谷氨酸棒杆菌（corynebacterium glutamic acid）发酵为例来说明控制发酵条件包括O2浓度、NH4浓度 、pH

8、、磷酸盐浓度、生物素浓度等，环境条件改变，可使代谢转换方向，不生成Glu，而生成乳酸、a-KGA、琥珀酸、谷酰胺等产物。,表3-1 环境因素对Glu产生菌发酵的影响,第三节 代谢控制发酵实例,一、丙酮酸的代谢控制发酵,（一）丙酮酸用途及生产状况 丙酮酸（pyruvic acid）又称a-氧代丙酸，a-酮基丙酸或乙酰基甲酸，为无色至淡黄色液体，呈醋酸香气和愉快酸味，是最重要的a-氧代羟酸之一。丙酮酸不仅在生物能量代谢中具有十分重要的作用，而且是多种有用化合物的前体。例如：治疗帕金森病的正多巴和L-半脱氢酸L-Leu、B6和B12的前体，也是合成氢化阿托酸，谷物保护剂等多种农药的前体，因此在化工、

9、制药和农用化学品等工业及科学研究中有广泛用途。,作为一种化工产品，丙酮酸早已实现工业化生产，但是直到20世纪90年代工业上生产 丙酮酸还沿用Howard Fraeer（1932）开发的酒石酸脱水脱羟法，没有多大改进，此法是将酒石酸+硫酸氢钾混合在220下蒸馏，馏出物再经真空精馏即可得丙酮酸，工艺简单易行。其主要缺点（1）丙酮酸产率较低（为酒石酒量的2930%）。（2）得到1g丙酮酸需消耗5g硫酸氢钾，以目前(酒石酸1.5万元/吨, 硫酸氢钾0.6万元/吨)市场价计算,仅原料成本至少需8万元/吨,为此在很长一段时间内, 丙酮酸的价格居高不下,限制其推广应用。1995年国外一些研究机构发表丙酮酸钙

10、在减肥保健上具有独特疗效的报道后，国外（主要是美国）对丙酮酸钙的需求量激活，刺激国内一些化工厂一拥而上，一时间国内丙酮酸（化学法）的生产能力达2000吨/年左右, 丙酮酸及其盐的市场价由当时28万元/吨降低到9万元/吨。如何解决丙酮酸的市场需求不断扩大，但其价格又无法进一步下降这一矛盾呢？显然开发成本更低的丙酮酸生产技术，即采用直接发酵或生物转化法是解决此问题的根本出路。,尽管一些微生物能够积累丙酮酸，但其产量无法达到工业生产要求而选育高产丙酮酸菌株十分困难，发酵法生产丙酮酸真正取得突破是1988年，日本东丽工业株式会社的研究人员宫田令子和米原撤选育出一系列丙酮酸产量超过50g/mL的球拟酵母

11、菌株，使得发酵法生产丙酮酸的工业化成为可能。1989年实现工业化发酵生产，其产酸率最高达67.8g/L。1992年日本开始采用发酵法生产丙酮酸产量为400吨/年,售价为4000日元/Kg。,（二）酵母代谢控制发酵生产丙酮酸,、丙酮酸脱羧酶（PDC）； 、丙酮酸转氨酶（PT）； 、丙酮酸羧化酶（PC）； 、丙酮酸脱氢酶复合体（PDH）。 NA和B1是丙酮酸脱氢酶系（PDH）的辅因子 Bio是丙酮酸羧化酶（PC）的辅因子 B6是丙酮酸转氨酶（PT）的辅因子 B1是丙酮酸脱羧酶（PDC）辅助因子,二、D-核糖代谢控制发酵,（一）D-核糖发酵机制,（二）D-核糖发酵的代谢控制育种,1、出发菌株选择 芽

12、孢杆菌属的细菌转酮酸缺陷突变株积累D-核糖具有普遍性。而Ecoli属伤寒沙门氏等细菌的转酮酸缺陷突变株并不积累核糖，都采用芽孢杆菌属细菌。,2、转酮酶缺陷突变株的分离（选育） （1）选育不利用D-葡萄糖酸或L-阿拉伯糖的突变株，因为D-葡萄糖酸和L-阿拉伯糖必须通过磷酸戌糖途径进行代谢，若转酮酶发生缺陷，那样菌体自然也就不能利用D-葡萄糖酸或L-阿拉伯糖。 （2）选育莽草酸缺陷突变株 （3）选育L-色氨酸-、L-酪氨酸-、L-phe-、CoQ-、Vk-或叶酸缺陷突变、莽草酸缺陷、4-赤藓糖合成受阻、 转酮酶-、转醛酶-。,3、其它标记 在维持转酮酶缺陷的情况下，进一步诱变使菌体带上具有高葡萄糖

13、脱氢酶活性和丧失孢子形成能力，可使D-核糖大量积累。葡萄糖脱氢酶是芽孢杆菌属序细菌的孢子所特有的酶，该酶由于NAD、NADP和NADH2、NADPH2会发生分子型的变换，结果在菌体对生长期被诱导，导致D-核糖大量积累，若生孢子D-核糖减少。,4、利用基因工程,日本岩木盾等人首先将枯草杆菌染色体DNA中的转酮酶基因克隆到载体质粒PUB110中，然后将氯霉素酰基转移酶基因插入到转酮酶基因之中，造成转酮酶基因的不可逆失活。经限制性内切酶Smal切后得到线状重组质粒，将该线状重组质粒转化到枯草杆菌宿主菌中，构建转酮酶失活的D-核糖工程菌株。其核糖产量达52g/L。小林等人将葡萄糖脱氢酶基因克隆到载体质

14、粒PHY300PLK中，然后转化到枯草芽孢杆菌中去。构建扩增葡萄糖脱氢酶的D-核糖工程菌，350C发酵80h可积累49g/LD-核糖。,5、发酵控制,发酵培养基： 碳源：葡萄糖、D-甘露糖、山梨醇、D-甘露醇、麦芽糖、乳糖、甘油、 糊精、可溶性淀粉等。 氮源：干酵母、酵母膏、牛肉膏、蛋白胨 、玉米浆 、（NH4）2SO4、CaCO3 。 要在好气条件下，pH中性，温度370C 。,三、r-亚麻酸代谢控制发酵,（一）丝状真菌利用葡萄糖生物合成r-亚麻酸的代谢途径,(二)高产r-亚麻酸 菌株的选育思路,图3-9 高产r-亚麻酸 菌株的选育思路,1、出发菌株 多采用被孢霉（Mortierella）毛

15、霉（Mucor）红酵母（Rhodotorula）小克银汉霉（Cunninghamella）等产油脂高的真菌作出发菌株。,2、切断或减弱支路代 a-亚麻酸-、花生四烯酸-、二十碳五烯酸- 花生四烯酸L、二十碳五烯酸L,3、解除反馈调节 选育脂肪酸结构类似物，如（LTBr），耐高浓度的r-亚麻酸突变株。,4、强化能量代谢 提高菌体细胞内ATP的水平有利于脂肪酸合成。 选育呼吸抑制剂（丙二酸、氰化钾、亚伸酸等）抗性突变株。 选育ADP磷酸化抑制剂（羟胺、2.4二硝基酚等）抗性突变株。 选育抑制能量代谢的抗生素(寡霉素、结元氨霉素、制霉素) 抗性突变株。,5、增加前体 菌体生物合成-亚麻酸与HMP、E

16、MP途径直接相关。增加HMP途径，NADPH的数量增多，有利于-亚麻酸产量的提高。过量的磷酸盐或通气不足会使EMP途径增强。而产生NADPH的HMP途径受阻，导致不饱和脂肪酸的合成降低。通过选育单氟乙酸敏感、碘乙酸敏感、萘啶酮酸敏感突变株，均有助于-亚麻酸产量的提高。另据报道，选育异柠檬酸脱氢酶渗漏突变殊，也有利于-亚麻酸产量的提高。,6、选育-6脱氢酶活力强的突变株 -6脱氢酶是生物合成r-亚麻酸关键酶之一。其活性高低直接与r-亚麻酸含量的高低密切有关，可采用选育呼吸缺陷型相反的方法，即呼吸增强型，通过诱变后菌株涂在含有TTC的一种无色的氧化还原剂的生长培养基上，若-6脱氢酶强，即可将TTC

17、还原成红色的物质，红色越强，表明菌体细胞内-6脱氢酶越强，r-亚麻酸的积累量也就越多。,7选育低温生长突变株 细胞膜是重要的微生物细胞表面结构，由脂质和蛋白质组成。脂质分子中不饱和脂肪酸的含量越高，其在低温条件下细胞膜的沉动性也就越大，即微生物细胞生长的温度就越低。据报道，选育在相对低温(15)条件下生长良好的突变抹，结果其-亚麻酸的产量提高了1.4倍。,8选育耐高糖的突变株 在代谢控制发酵中，常采用耐高渗透压突变株。-亚麻酸发酵与培养基中糖浓度有密切关系，在一定范围内，-亚麻酸的产坠随糖浓度的增加而增加，但糖浓度过高就会抑制菌体生长。降低产物的积累。因此，通过选育耐高糖的突变抹。可使菌体高效

18、率地利用葡萄糖，从而提高-亚麻酸的产量。,四、柠檬酸代谢控制发酵,2001年以来世界柠檬酸的产量为100万吨左右，2004年我国柠檬酸产量达45万吨，其中80%出口，已经成为世界柠檬酸生产和销售大国。我国柠檬酸发酵水平：薯干粉产酸12%，发酵周期64h，转化率95%；玉米粉液化液产酸15%，发酵周期5464h，转化率95%以上。,(一)黑曲霉生物合成柠檬酸有机酸及多元醇途径,1、葡萄糖氧化酶 2、内酯酶 3、己糖激酶或葡萄糖激酶 4、P-葡萄糖异构酶 5、果糖运输 6、己糖 7、1-P-甘露（糖）醇脱氢酶 8、1-磷酸甘露（糖）醇磷酸（酯）酶 9、甘露（糖）醇运输 10、磷酸果糖激酶 11、醛

19、缩酶 12、丙糖-P异构酶 13、3-P甘油醛脱氢酶 14、丙酮酸激酶 15、丙酮酸羧化酶 16、草酰乙酸水解酶 17、草酸运输 18柠檬酸运输 19、苹果酸脱氢酶 20、三羧酸载体 21、柠檬酸合成酶 22、丙酮酸脱氢酶系,1、葡萄糖化酶是胞外酶，直接受环境pH的影响。当pH3.5时,此酶失活,当一旦柠檬酸积累使pH降至1.8,从而导致葡萄糖氧化酶失活。,2、草酸是由草酰乙酸水解酶的催化生成的，该酶是细胞质酶，草酰乙酸水解酶的生物合成也受外界pH值调节，尽管其调节机制现还没有搞清楚，但是研究表明诱导此酶的最适pH值为56，而当pH为2时，仅观察到非常低的酶活性。过去采用糖蜜，孢子接种发酵pH

20、太低，不利于b孢子萌发，一般发酵前期控制pH56，因此存在少量的葡萄糖或草酸，现在我国采用淀粉质原料的液化液，并采用菌丝大接种量接种，再加上我国的黑曲霉产的糖化酶是耐酸的，因此当黑曲霉大量繁殖后，就产生柠檬酸，发酵液的pH是较低的。,3、多元醇（甘露醇、赤藓醇、丙三醇甘油）是由糖生成的，一旦糖类底物被耗尽，它们就会遭到再次分解，因此只要糖类底物最终能全部消耗多元醇就不可能是影响柠檬酸最终产量的主要因素。 综上所述高产Asp nger柠檬酸产生菌应该在发酵中只生成柠檬酸。事实上，经天津工微所的研究表明，控制好发酵条件，我国柠檬酸产生菌的发酵液经低层析，只有一个柠檬酸斑点。,（二）黑曲霉生物合成柠

21、檬酸机制,五、赖氨酸代谢控制发酵,（一）赖氨酸生物合成途径及调节机制 微生物合成Lys的途径主要有两种： 1.在霉菌和酵母中的L-赖氨酸是经-氨基己二酸途径：,酿酒酵母：同型柠檬酸合成酶存在两种同功酶（HS，HS），它们都受Lys相同程度的反馈抑制，HS较易受L- Lys阻遏。 薄膜假丝酵母：同型柠檬酸合成酶也存在两种同功酶，但只有HS受Lys反馈抑制。 解脂复膜孢酵母：没有发现同工酶，其HS强烈受Lys反馈抑制。 产黄青霉菌：同型柠檬酸合成酶受Lys和青霉素G的协同反馈抑制。,2、在细菌、蓝、绿藻中存在另一条重要的途径。是以天冬氨酸为起点，经二氨基庚二酸（DAP）生物合成L- Lys，称为天

22、冬氨酸途径，亦称-二氨基庚二酸途径。 E.coli和黄色短杆菌，（谷氨酸棒杆菌等Glu产生菌）是研究较为深入的两类细菌，具有一定的代表性。 在大肠杆菌合成Lys的天冬氨酸途径中，含有三种ASP激酶（AK）同功酶和两种高丝氨酸脱氢酶（HD）同功酶，每个同功酶受不同终产物的反馈调节，而且每个分支途径后的初始酶分别受各自产物的反馈抑制。如Lys分支途径第一个酶和第二个酶（二氢吡啶二羧酸合成酶与二氢吡啶二羧酸还原酶）受Lys的反馈抑制等。然后在黄色短杆菌，谷氨酸棒杆菌，乳糖发酵短杆菌等Glu生产菌中的关键酶AK却都是单一的，该酶受Thr+Lys的协同反馈抑制。此外还有以下与大肠杆菌不同：,(1)没有发现对ASP激酶（AK）或天冬氨酸半醛脱氢酶的反馈阻遏。 (2)Lys分支途径的第一个酶和第二个酶（二氢吡啶