生物样品超薄切片技术

1、生物样品,常规制样技术,特殊制样技术,第四章 透射电镜生物样品 制备技术,第一节 载网和支持膜 第二节 超薄切片的制作 第三节 负染色技术,第一节 载网和支持膜,一、载网：用于承载样品的(直径为3mm)网状材料。,1.载网的类型及选择：,70的透过率,2.载网的清洗：酸碱法或有机溶剂、蒸馏水等洗净干燥。,X射线元素分析,常规超薄切片(200目以上),细胞化学,二、样品支持膜,为了增强样品的强度，在载网表面先覆一层薄膜。,1.对膜的要求：,本身没有结构，薄而透明，电子束易通过； 有足够的机械强度，经得住电子束的轰击； 不与样品发生化学反应。 厚度在1015nm,2.常用支持膜及其制备,福尔莫瓦膜

2、（Formvar):,化学名称：聚乙烯醇缩甲醛. 特点：机械强度高，制作简便. 制作：0.20.5的氯仿溶液，玻璃片汆出,水面剥离法。,操作方法,1.福尔莫瓦支持膜的制作方法,2.火棉胶膜用平皿水面展开法：,平皿中盛有双蒸馏水，滴两滴13%的火棉胶膜液， 待片刻溶剂挥发后，在膜上摆放洁净的铜网，滤纸捞起。,3.碳膜制作：用真空喷镀法制膜。,第二节 超薄切片的制作,超薄切片：是指厚度小于100 (5070)纳米的切片。,要求：厚薄均匀、厚度符合标准； 无皱褶刀痕、震颤和沉淀； 细胞结构保存良好，具有良好的电子反差； 具有一定程度的机械强度。,制作流程：包括六大步，40多次操作,取材固定脱水包埋切

3、片染色,镜检,超薄切片制作流程图,一、取材,从动、植物机体上或细胞及微生物培养物中 获取所需要的研究材料的操作过程。,1.取材的原则要求：准、快、小、冷、轻五字原则。,准确：根据研究目的确定取材部位，取到典型部位。 快速：材料离体后应在1分钟内投入固定液。 体积小：固定液渗透力所限，样品体积为1mm 或13mm长条。 低温：固定液及器材需预冷(04 )，以降低自溶酶的活性。 防损伤：器械要锋利，切割轻巧，防挤压、牵拉损伤 组织细胞的内部结构。,取材 固定 脱水 包埋 切片 染色 镜检,2.取材方法：,动物材料的获取：,急性处死或麻醉后，在12分钟解剖出所需材料，切成 标准块立即投入固定液，低温

4、(04)保存；特殊难 取的材料必须原位固定或灌流固定，再取材投入固定液。,植物材料的获取：,叶片切取13长条；根、茎切取标准块；表面有毛刺的 材料先用酶处理使之软化，表面有蜡质的叶片先脱蜡， 蒸馏水洗净后再取材固定。,悬浮样品的获取：,加入适量固定液悬浮固定后，低速离心收集成团块再固定。,保低温,野外取材：,携带冰壶保存固定液和材料，确保动物材料的现场固定； 植物材料可保湿带回实验室再取材固定。,取材 固定 脱水 包埋 切片 染色 镜检,二、固定,用化学或物理的方法迅速杀死细胞的过程,1.固定的目的：,在分子水平上真实地保存组织细胞生活 状态的细节，尽量减少细胞的死后变化。,2.固定的类型：,

5、3.固定液的作用：,迅速均匀渗透到细胞内部，稳定各种细胞成分； 破坏细胞的酶系统，阻止细胞的自溶； 通过化学作用建立分子交联，形成细胞骨架； 提供一定的电子反差。,超低温快速冷冻固定法,使用化学试剂快速杀死细胞,取材 固定 脱水 包埋 切片 染色 镜检,12.0%,4.常用固定剂及其特点,醛类：,甲醛、戊二醛、多聚甲醛和丙烯醛,戊二醛：,穿透力强，能很好固定蛋白质和糖元、保存核 酸、核蛋白，对微管、内质网等细胞膜系统保 存较好；不能保存脂类物质，无电子染色作用。,配制方法：常用0.1M的磷酸盐缓冲液(pH6.87.2) 配成2.05.0。,选用：,单细胞 微生物 动物组织 植物组织 厚壁组织,

6、5.0%,锇酸(OsO4),是唯一能保存脂肪的固定剂，具有电子染 色作用。能固定脂蛋白、核蛋白，不能保 存核酸和糖类。,取材 固定 脱水 包埋 切片 染色 镜检,5.固定方法：,(1)单固定法：,用于易于渗透的材料和酶的细胞化学,(2)双固定法：,戊二醛锇酸双重固定,(3)原位固定法：,用于难解剖的、对缺氧敏感的组织器官， 在保持血液供应的状态，边解剖边滴加固定液， 待组织适度硬化后再取材作常规固定。,(4)灌流固定：,通过血液循环的途径，将固定液灌注到相应部位， 待组织适度硬化后再解剖取材，作常规固定。,戊二醛,取材 固定 脱水 包埋 切片 染色 镜检,直接影响被固定细胞的原有特定形态,6.

7、影响固定效果的因素,(1)固定液的酸碱度：,固定液的酸碱度必须与被固定材料的酸碱度基本一致。,例如多数动物的pH值平均为7.4，所以常用PH7.27.4； 植物体的pH值为6.87.1，所以常用PH7.07.2； 原生动物及胚胎适于pH为8.08.5，胃黏膜pH为8.5 效果最佳；,(2)固定液的渗透压：,固定液与被固定组织之间必须保持渗透平衡。,电解质：钾钠钙(0.5% CaCl)可防止膨胀 非电解质：蔗糖、葡萄糖膜系统稳定剂,取材 固定 脱水 包埋 切片 染色 镜检,（3）缓冲液类型,磷酸盐缓冲液：,仿效细胞外液成分配制，无毒且富有生 理功能。适于配各种固定液和材料漂洗液。,二钾胂酸盐 缓

8、冲液,有毒，稳定性好。适用于细胞化学和 保存脂肪的样品处理、钙离子定位研究,不宜长期保存,可长期保存,取材 固定 脱水 包埋 切片 染色 镜检,(4)固定时间、温度及样品块大小,时间：因材料而异，单细胞和动物材料较短，植物材料 及厚壁组织较长。112小时。,温度：,低温以抑制酶的活性，通常在04条件固定。,样品块大小：,受固定液渗透能力影响，小块材料易得到 良好固定。,取材 固定 脱水 包埋 切片 染色 镜检,7. 注意事项,（1）控制固定温度04利于抑制酶的活性，减少细胞 自溶。,（2）掌握固定时间：根据材料类型和特点而定，后固定 时间不宜太长，否则易造成碎片。,（3）充分漂洗：除去残留固定

9、液。,（4）特殊材料的特殊处理：,植物及较疏松的材料：抽气使其沉入固定液中； 厚壁组织：采用低压容器或振荡方式促进渗透； 表面有蜡质的材料：应该先脱蜡后固定。,取材 固定 脱水 包埋 切片 染色 镜检,三、脱水,脱水指用适当的有机溶剂，取代组织细胞中 的游离水的过程。,1.必要性：,水分存在会影响非水溶性包埋剂的渗透，进而影响切片的完整性,2.常用脱水剂：,醇类(乙醇)和丙酮,3.脱水方法：梯度系列脱水法。,30%50% 70% 80% 90 %95% 100%2次,4.注意事项：,脱水中断只能在70%，高浓度脱水剂易使组织变脆，成分抽提； 末级脱水剂应先用吸水剂处理，以保证脱水彻底； 高浓度

10、脱水操作要快，以防样品内进入空气或吸水受潮。,取材 固定 脱水 包埋 切片 染色 镜检,四、浸透与包埋：,用包埋剂逐步取代样品中的脱水剂，使细胞内外的 所有孔隙都被包埋剂填充，聚合后形成适合机械切 割的固体包埋块。,1.包埋剂：,理想包埋剂的特点：粘稠度低，容易渗透；聚合均匀， 不产生体积收缩；耐电子束轰击，高温不变形，不升华； 本身无结构，并具有良好的切割性能，切片易染色。,常用包埋剂：非水溶性(Epon812)和水溶性包埋剂。,包埋剂 Epon812或618 固化剂 DDSA（十二烷基琥珀酸酐） MNA（六甲酸酐） 增塑剂 DBP（邻苯二甲酸二丁脂） 催化剂 DMP-30,用于618,边脱

11、水边包埋,取材 固定 脱水 包埋 切片 染色 镜检,2.浸透,四.浸透与包埋,脱水后经环氧丙烷过渡,再逐渐浸入包埋剂。,包埋剂:过渡剂比例为 1 :31 :13:1纯包埋剂,浸透时间：因材料而异,3.包埋,常规包埋：用牙签把材料挑入模具，注入包埋剂，做好标记； 定向包埋：样品挑入浅槽，摆好方向、注剂、装标签； 注意事项：样品块附近不能存在气泡。,4.聚合,37 (12h)45(12h)60(24h),取材 固定 脱水 包埋 切片 染色 镜检,五、超薄切片,制刀修块切片展片捞片,1.切片刀：,钻石刀、玻璃刀,制作玻璃刀：,2.修块：,除去样品周边的包埋介质和不感兴趣部位，保留 有用信息便于切割，

12、提供尽可能大的有效观察面。,要点：上、下边必须平行,形状：顶端面为梯形的锥体（金字塔形）,取材 固定 脱水 包埋 切片 染色 镜检,3.切片,装刀、加水：特别注意刀高和倾角，液面高度；,切片、捞片：切片带用睫毛笔收集，铜网沾取；,切片厚度的判断：切片表面的反射光和切片下表面反射光 产生的干涉颜色为依据，不同厚度切片呈现不同的颜色。,取材 固定 脱水 包埋 切片 染色 镜检,六、染色,1.染色原理：使用重金属盐类与样品中的某些成分结合或 被吸附，以增加电子散射量从而达到提高反差的目的。,电子染色,2.电子染色剂：,具有特异性,常用染色剂为铀和铅盐,醋酸铀：能提高核酸、蛋白质和结缔组织的反差， 对

13、膜系统染色较差。,配制： 13%的50%或70%的乙醇溶液，避光保存。,铅盐：对膜系统、糖元、核蛋白、脂类有较好的染色作用。常用 硝酸铅和柠檬酸钠水溶液配成柠檬酸铅。易产生沉淀污染样品。,配制： 硝酸铅 1.33g 柠檬酸钠 1.76g 双蒸馏水 30ml,pH 1112,pH4.2,用力振荡30min，呈乳状悬液，加入8ml 1N的NaOH，溶液透明后加水至50ml,取材 固定 脱水 包埋 切片 染色 镜检,3.染色方法,(1)单染色：只用一种染色液（铀）染色的方法。,(2)双染色：铀铅染色法,(3)块染色：,铅铀铅染色可提高反差,铀染2030分钟,铅染色1530分钟,水洗303次,材料固定

14、后、脱水前，整块用50%乙醇醋酸铀饱和溶液， 4染色212小时，常规切片镜检。,取材 固定 脱水 包埋 切片 染色 镜检,4.示踪性染色,多用于免疫电镜技术和(酶)细胞化学技术,取材 固定 脱水 包埋 切片 染色 镜检,(1)概念：用各种大小的离子、分子等颗粒作为示踪物， 显示细胞间的连接部位与方式，研究细胞的通透屏障，测量通透孔道的大小，追踪组织液的生理通路。,（2）常用示踪剂：硝酸镧（2nm），辽红（0.76nm）， 无机胶体金，草酸钙以及酶类，铁蛋白等。,(3)染色方法：,通常将示踪剂加入进所有的处理液中。,硝酸镧标记的葱根尖细胞 镧颗粒沉积在细胞间隙,免疫电镜技术：,将免疫学中抗原-抗

15、体反应的特异性与组织化学形态的可见性， 利用电镜的高分辨率和放大能力，在超微结构和分子水平上 研究细胞的形态和功能。 可以进行细胞内抗体-抗原的定性、定位研究。,如：免疫铁蛋白、酶（辣根过氧化酶）、胶体金 对铁蛋白抗体、酶标记抗体、胶体金标记抗体的定位,电镜细胞化学技术：,尽可能保存细胞超微结构的同时，在原位将生物化学的 反应在电镜下显示出来，从而将结构与功能的研究结合起来。,如：酶在细胞内的定位 核酸（DNA、RNA）脂肪、碳水化合物的定位 各种无机离子（钙离子）定位等,胶体金标记的叶绿体,超薄切片制作小结,一、制作环节应掌握“六要一防”,取材要准确 固定要及时 漂洗要充分 脱水要彻底 浸透

16、要完全 切片要均匀 染色防污染,二、不同材料制作特点：,动物组织：取材迅速，固定及时； 植物材料：调节处理时间，确保渗透彻底； 游离细胞：注意收集，以防样品丢失； 孢粉、花粉以及藻类：预包埋收集，完全浸透。,三.处理时间,准确 防损伤,24h,3次/15min,12h,8 级/ 15min,34h,2次/15min,3级/48h,铀染：1530min 铅染：1015min,500700,微黄色,黑色或 深褐色,防止污染,第三节 负染色技术,一负染色及其原理：,1.负染色：即阴性染色,利用高电子密度、并且在电镜下不显示结构的重金属 盐类在样品四周的堆积而增强样品外围的电子密度，从而衬托出样品的形

17、态和大小。,2.原理：电子束通过原子序数高的物质时，与其电子和原 子核碰撞的几率较高，容易发生散射而形成负反差。 任何物体若被密度比本身大2倍以上的物质所包围或 浸没时，电镜下反差得到加强而形成负反差。,二.负染色样品的制备,具有一定浓度和纯度的悬浮液,（一）直接取样法：,用于含杂质少而具有一定浓度的样品,1.生长在固体培养基上的微生物：用接种环刮下配成 双蒸馏水悬浮液即可滴样或沾样。,2.放线菌孢子：双蒸馏水从菌体上洗下成悬液即可滴样。,3.皮肤疱疹（水痘等）用毛细管穿刺取样，直接滴膜。,4.植物染病体：切碎后双蒸馏水悬浮片刻即可沾样。 需保持活体的植物，刺破表皮处滴加蒸馏水， 待病毒游离出

18、来即可沾样。,负染色样品的制备,（二）样品提纯法：用于杂质较大的材料,1.离心提纯法：,用于血清、粪便、尿样、痰液、 活组织、植物研磨破碎悬浮液,低速离心：25003000rpm,10min,弃沉淀（细胞碎片） 高速离心：15000rpm,60min,取沉淀适当稀释即可沾样。,2.透析提纯法：,除去盐类杂质,样品滴在漂浮在水面的膜是 甲醛蒸汽固定1520分钟 静置透析324小时 捞网染色,3.琼脂过滤提纯法：,琼脂过滤20分钟 蒸馏水漂浮剥离 捞膜染色,(三)病毒样品浓缩方法,1.红血球吸附法：,用于多数黏液病毒和副黏液病毒浓缩,病毒悬液与等量红血球混合静置5分钟使病毒粒子吸附于红血球上； 低

19、速离心（1000转以下）15分钟，弃上清； 加入少量生理盐水，低温（4）静置34小时使病毒释放于溶液中； 取该悬浮液即可滴膜负染。,吸附离心分离悬浮滴染,2.细胞低渗释放法,将培养细胞刮下低速离心，弃上清； 在沉淀中加入4倍体积蒸馏水，使细胞因低渗膨胀破 裂而释放出病毒，再快速冻融数次； 再低速离心，取上清液滴膜负染。,3.抗体病毒凝结法：形成“病毒抗体”复合物离心浓缩， 取沉淀制成悬浮液样品即可负染色。如：风疹病毒、 肝炎病毒。,4.植物染病体：低温保存研磨破碎离心上清液负染色,四.负染色剂,密度比生物样品大四倍以上的重金属盐类,(一)负染色剂的特征:具有较高的电子密度和散射能力； 较高的熔点；较高的溶解度，不易析出沉淀；分子小易 渗透；化学稳定而不与样品发生化学反应。,(二)常用负染色剂及其特点,1.磷钨酸(PTA)、磷钨酸钾(KPT)、磷钨酸钠(NaPT),特点：颗粒细，反差好，图象背景干净; 溶液：13%的水溶液(p