噬菌体表面展示技术.ppt

1、噬菌体展示技术,一、定义,噬菌体展示技术(Phage Display Techniques ,PDT)是一项筛选技术，将 外源多肽或蛋白与噬菌体的衣壳蛋白融合表 达，融合蛋白展示在病毒颗粒的表面，而编码该融合子的 DNA则位于 病毒粒子内。 使大量多肽与其DNA编码序列之间、表型与基因型之间建立了直接联系，使各种靶分子（抗体、酶、细胞表面受体等）的多肽配体通过淘选得以快速鉴定。,表型基因型 展示肽编码基因,二、发展简史,Smith 在 1985 年首次证实外源 DNA 可以插入丝状噬 菌体基因 III 中，并与 pIII 蛋白融合展示。 Smith GP. Science 1985; 228:

2、1315-7,1985 第一次发表噬菌体展示技术；展示多肽 Smith GP. Science.1985; 228:1315-7 1988 噬菌质粒系统 1990 抗体片段的展示 1993 展示cDNA文库 1994/1995 研发了phage two-hybrid技术 1996 首次体内in vivo 淘选试验 1998 噬菌体展示载体作为基因导入载体 1999 Combination of phage display with high-density arrays 2001 Automated phage display selection Killing cancer cells by

3、 targeted drug-carrying phage nanomedicines Published: 3 April 2008 BMC Biotechnology 2008, 8:37 doi:10.1186/1472-6750-8-37,三、噬菌体展示的基本原理,基本原理 在噬菌体衣壳蛋白基因中插入外源基因，形成融合蛋白表达在噬菌体颗粒蛋白的表面，被展示的多肽或蛋白质可保持相对独立的空间结构和生物学活性。,利用靶分子，采用适当的淘洗方法（亲和洗脱扩增亲和的循环步骤），洗去非特异结合的噬菌体，最终从噬菌体文库中筛选出能结合靶分子的目的噬菌体；外源多肽或蛋白质表达在噬菌体的表面，而其编码

4、基因作为病毒基因组中的一部分可通过噬菌体DNA 序列测序出来，使得表达蛋白（表现型）和编码基因（基因型）之间完美地结合起来，为生物科学提供高效而实用的研究手段。,四、噬菌体表面展示的步骤,不同基因分别被插入噬菌体基因组中 分离纯化的噬菌体只是展示一个蛋白，多肽或者抗体。 收集所有的噬菌体就构成一个文库将噬菌体文库与靶蛋白相互作用，筛选能与靶蛋白相互作用的噬菌体,目前，能用于蛋白质/多肽展示的噬菌体系统有丝状噬菌体展示系统、噬菌体展示系统、T4噬菌体展示系统和T7噬菌体展示系统。 其中丝状噬菌体展示P系统单价展示，可以筛选高亲和力配体，P系统拷贝数高，利于疫苗的研制，但丝状噬菌体分泌释放，不易展

5、示大分子蛋白； 噬菌体展示和T4噬菌体展示系统容量大，拷贝数高，但不易筛选高亲和配体；T7展示系统可以高、中、低拷贝地展示不同分子量的蛋白质，是目前最为理想的展示系统。,五、噬菌体展示技术的应用现状,噬菌体抗体库技术 噬菌体抗体库技术模拟了机体免疫系统的选择作用，呈现在噬菌体表面的抗体能够在体外用固相化抗原进行筛选，同时由于噬菌体对大肠杆菌的感染性，噬菌体抗体库技术能够以淘筛的方式，为快速选择特异性抗体提供简便而高效的操作系统 。,疫苗： 与传统的质粒DNA疫苗相比,利用噬菌体展示技术研制基因工程疫苗具有独特的优势：噬菌体传递的DNA 疫苗诱生的抗体应答持续时间更长, 滴度更高；噬菌体有强的免

6、疫原性，是天然的免疫佐剂；噬菌体疫苗在对核酸酶的稳定性方面的优势明显，而且噬菌体疫苗能直接靶向抗原提呈细胞，使用比质粒DNA疫苗低得多的剂量就能诱发很好的免疫效果。,3. 多肽类药物： 如一些激动剂或拮抗剂从多肽库中分离鉴定出来；已获得一13 肽，它能中和蛇毒 -bungarotoxin；从CX7C 多肽库中掏选到一个多肽能与 Hantavirus 结合，并使该病毒不能结合或感染细胞。人血管促生素（angiogenin）是一种能促进肿瘤血管生长的蛋白，用这个蛋白去淘选一个噬菌体展示多肽库，所获得的一个环状8肽能与血管促生素结合，并能阻遏血管促生素的活性；等等。,肿瘤药物导航载体： 用肿瘤细胞特

7、殊的受体蛋白从展示文库中淘选到的多肽或单链抗体，可以作为抗癌药物的定向输送工具 。一个成功的实例是：将噬菌体多肽展示库注射入具有肿瘤的小鼠体内，然后杀死小鼠，取出肿瘤，再将结合其上的噬菌体洗脱下来。展示在其上的多肽具有与该肿瘤的特异性亲和力。将此多肽与细胞毒素 doxorubicin 偶联。结果显示，此偶联物具有更强的抑制肿瘤的效果.,5.信息传递研究: 利用噬菌体展示多肽库，发现了一些受体，如凝血致活酶、黑皮质素受体、CD80 和一个 Hantaviral 受体；受体的配体， 如血管促生素、 -bungarotoxin， 和一些大蛋白分子中的折叠区域，如SH2、SH3 和 WW 区域。从多肽

8、库中可分离到与天然激素相似的、与受体结合的高亲和力的多肽, 因此用完整细胞可以从多肽库中找到受体的高选择性配体。在不知道任何有关的受体和配体信息的情况下，用完整细胞和组织或动物，可筛选到特异与靶组织结合的多肽和蛋白。,6.DNA结合蛋白： 锌指蛋白是一类 DNA 结合小肽结构物，这些结构含有锌，能用于构建一个大的蛋白区域，去识别和结合特殊的 DNA 序列。噬菌体展示技术也可以用于创造一个大的、具有识别不同 DNA 序列的 锌指的多肽库。利用这个多肽库，可以研究有关氨基酸序列与 DNA 结合位点之间的识别规则，可以通过设计 锌指多肽去控制基因的表达，比如抑制小鼠细胞系中的癌基因，也可以启动表达质

9、粒的基因，或干扰病毒感染生活周期。,7.蛋白质组学： 噬菌体展示技术作为一个多肽和蛋白质合成的工具箱，使得任何蛋白均能找到与其有特异结合力的多肽和蛋白质，其构建的文库的滴度可达1012。蛋白质组学的基本点就是利用蛋白质-蛋白质的相互作用，对成千上万种蛋白质同时进行分析。而噬菌体展示技术正好能符合这种要求。例：将噬菌体展示cDNA 文库制成蛋白点阵，成功的应用于寻找与过敏症有关的蛋白质。,目前噬菌体展示技术的研究进展非常迅速，在抗原决定簇的定位、蛋白质相互作用位点的确定、特异调节分子的分离和人工抗体和疫苗的制备、诊断技术、酶抑制剂的研究开发、多肽药物的研制等生物技术研究的不同领域得到了应用，并对

10、这些领域产生了深远的影响。,噬菌体展示技术的优势,噬菌体展示技术最关键的优势有： 第一，淘选的高效率使得在极低的存在 水平下，挑选到高亲和力噬菌体成为可能； 第二，所挑选到的噬菌体可在微量存在的情况下，通过感染细菌得到富集； 第三：展示的多肽或蛋白质与其包含在噬菌体内部的基因密码的连接，使得结合肽或蛋白质的序列分析既快速又简便。,噬菌体展示技术的局限性,（1）在噬菌体展示过程中必须经过细菌转化、噬菌体包装，有的展示系统还要经过跨膜分泌过程，这就大大限制了所建库的容量和分子多样性。目前，常用的噬菌体展示文库中含有不同序列分子的数量一般限制在109。 （2）不是所有的序列都能在噬菌体中获得很好的表达，因为有些蛋白质功能的实现需要折叠、转运、膜插入和络合，导致在体内筛选时需外加选择压力。例如，在噬菌体展示文库试验中，由于部分未折叠的蛋白在细菌中很容易被降解，因此，必须小心控制条件，以保证在噬菌体表面展示的文库没有降解。另外，鼠源抗体在噬菌体中表达差，也是