第二章色谱法基本原理.ppt

1、第二章 色谱基本原理,2.1 概论 2.2 色谱分配平衡 2.3 塔板理论 2.4 速率理论 2.5 影响谱带扩宽的其他因素 2.6 分离度及其影响因素 2.7 分析时间的最佳化,2.1 概论,2.1.1 色谱基本流程,流动相,进样器,流速控制与测量,色谱柱,检测器,数据记录与处理系统,2.1.2 色谱流出曲线及常用的术语和参数,色谱流出曲线（色谱图） 指色谱柱流出物通过检测器系统时所产生的响应信号对时间的曲线图称色谱流出曲线。,2.1.2 色谱流出曲线及常用的术语和参数,（1）基线 ：实验条件下，只有纯流动相通过检测器时的记录信号,基线稳定,基线漂移,基线（低频）噪声,基线（高频）噪声,（2

2、）色谱带：组分在柱内的浓度分布构型,（3）色谱峰：组分通过检测器产生的响应信号 记录的微分曲线。,（4）峰高 ：色谱峰顶到基线的垂直距离,（4）保留值 ：组分在色谱床中的滞留情况,用时间表示,保留时间 t R 死时间 t M 调整保留时间,用体积表示,死体积,保留体积,调整保留体积,室温下，皂膜流量计测得的流速,大气压（柱出口的压力）,室温时水的饱和水蒸气压,柱温,室温,校正保留体积 ：柱内平均压力下的平均流速 乘以保留时间所得到的体积。,j 压力校正因子,式中： 为大气压, 为柱前压力,净保留体积:,比保留体积 :指 时每克固定液的净保留体积,式中: 为柱温， 为固定液重量,相对保留值r2,

3、1：两个不同组分的调整保留值之比。,（6）区域宽度 :色谱峰的宽度,标准偏差 ：0.607倍峰高处色谱峰宽度的一半 半峰宽 ：,峰底宽度:,2.2 色谱的平衡,2.2.1分配系数与柱温的关系,在一定温度下，分配体系达到平衡时，组分在两相的浓度之比称为分配系数K。,K由组分和两相的热力学性质决定，随柱温而变化。,当色谱体系和分离对象确定以后， K 只与柱温有关， 其关系式为 ：,一般情况组分在固定相的 为负值，则 与 成反比。,2.2.2 分配比,（分配容量、容量因子、容量比）,指在一定的柱温下，组分在两相达到分配平衡时，分配在固定相和流动相的总量之比。,式中， 称为色谱体系相比( ),注意 ：

4、,1 是指真正参与组分在两相分配的那一部分有效体积 分配色谱固定液的体积 吸附色谱吸附剂表面积 离子交换色谱离子交换剂的交换容量 排阻色谱多孔固定相孔容 2 为柱内流动相的体积（柱死体积）,流动流动相,停滞流动相,实际测定时包括了进样器，连接管，检测器的死体积。,2.2.3 分离因子（选择比、溶剂效率）,对一定色谱柱，两相的体积比 一定，则,不同浓度溶液中溶质迁移所引起的自由能 变化，对组分1和组分2有：,两组分自由能变化的差值 应为,当 时， ，组分不能分离。 主要由两相的性质决定。同时也会受柱温的影响。 与柱长、柱径、流动相速度、柱填充情况无关。,2.2.4 分配等温线,分配系数随组分浓度

5、变化的规律称 为分配等温线。典型的分配等温线有三种， 线性、凸型、凹型。,a,b,c,k与C无关,C增大，K减小,C增大，K增大,2.2.5 基本保留方程式,组分在柱内的移动速度取决于组分在两相中的分配。,组分在固定相时，迁移速度 组分在流动相时，迁移速度 所以，有保留组分谱带的迁移速度,设色谱柱长 对于溶质分子:,对于流动相分子:,( 可从色谱图直接测定）,若用保留体积 代替 ，则,因为：,基本保留方程式,所以, 因为保留值与有关,装置改变时保留 值不同,色谱基本保留方程式的物理意义, 组分的保留值取决于组分的K和色谱体系的, 色谱装置 (VM与Vs)一定时,相比一定,组分保留值取决于K(组

6、分的本性),故可作为定性的依据,色谱流出曲线的意义： 色谱峰数=样品中组份的最少个数； 色谱保留值 色谱峰高或面积 色谱保留值或区域宽度色谱柱分离效能评价指标； 色谱峰间距固定相或流动相选择是否合适的依据。,定性依据；,定量依据；,例1：在某色谱分析中得到下列数据：保留时间（tR）为5.0min，死时间（tm）为1.0min，液相体积（VS）为2.0mL，柱出口载气体积流速（FO）为50mL/min，试计算：（1）保留因子k（2）死体积Vm（3）分配系数K（4）保留体积VR,解：,（1）k= tR/ tm=（5.0-1.0）/1.0=4.0,（2） Vm = FO tm =50 1.0=50m

7、L,（3） K = k Vm / VS =4.0 50/2.0=100,（4） VR = FO tR =50 5.0=250mL,2.3 塔板理论（plate theory）,1941年，马丁等人提出了塔板理论,把色谱分离过程比作分馏过程，把色谱柱比作一个分馏塔，并作了四个理想的假设：,2 流动相从柱入口每次以一个 的体积不连续进入,3 组分的 在所有的塔板上均为常数,4 忽略塔板间的纵向分子扩散,1 在柱内一小段长度H内，组分在两相瞬间达到分配平衡，这一小段柱称为一个“理论塔板”，它的长度称为理论塔板高度,K,根据以上假定的条件，讨论组分在两相间的移动分配过程，,假设：,(2) 加入柱内的流

8、动相脉冲塔板数N,(1) 色谱由5块理论塔板组成，塔板号r0，1，2，3，4,(3) 当加入一个塔板体积 脉冲流动相到0号塔 板时，原来塔板中流动相中的组分就依次冲到 下一个塔板，并在两相间重新分配并达到平衡,(4)塔板上流动相的组分数为q，固定相中的组分数为p。,经过N次转移后，分配在各塔板上的组分数符合二项式分布：,(p+q)N,p和q可以从组分的分配比来计算确定。,若组分A的kA=2.0 (p=0.667 , q=0.333),组分B的 kB=0.5 (p=0.333,q=0.667),经过4次转移以后，各塔板上A 、B组分的含量符合由二项式展开后所得的各项值：,(p+q)4 = p4

9、+ 4qp3 + 6q2p2 + 4q3p + q4 A组分： (0.333+0.667)4 =0.198+0.395+0.296+0.0990+0.0120=1.000 B组分： (0.667 + 0.333)4 =0.0124+0.0990+0.296+0.395+0.198=1.000,A、B组分在柱内各塔板中的浓度分布见表3-1,N=0,组分加到0号塔板上,平衡时,N=1，进1V载气,平衡时,0.25,N=2,进2V载气,0.125,平衡时,N=3,进3V载气,平衡时,0.063,N=4,进4V载气,平衡时,0.032,0.125,N=5,进5V载气,平衡时,0.032,N=6,进6V

10、载气,平衡时,N=7,进7V载气,平衡时,以组分数在柱出口出现的分数为纵坐标，流 动相板体积N为横坐标作图，就得到色谱流出的 曲线。当理论塔板数N50时， 就可以得到较理 想的对称峰形。 GC: N=103-106, 流出曲线趋于正态分布曲线,色谱峰为正态分布时，色谱流出曲线的浓度变化方程：,m为组分质量，VR为保留体积，N为理论塔板数。 当流动相体积V=VR 时，C值最大，即：,当VR-V=1/2W1/2时：,式中N为理论塔板数，W1/2，分别以体积、 时间为单位的色谱峰半高宽度。,由塔板理论可以导出理论塔板数n的计算公式,式中：tR，,，,，,的单位必须相同。,对于长度为L的色谱柱，理论塔

11、板高度为：,由于柱内的死体积Vm（或tm）不反映出各 组分与固定相相互作用的本质，在考虑实际柱能 时，应扣除死保留值，以有效塔板数neff作为衡量 柱效能的指标。,，则：,上式可以看出：,都随,值变化,很小时，,，,和,使用不同的,值的组分，测出的柱效是不同的,2.4 速率理论（rate theory）,速率理论首先由荷兰学者Van Deemter 等提 出,导出气相色谱速率方程，称为Van Deemter方 程.后来美国科学家J.Calvin Giddings提出了随机 行走的紊流理论模型，并对速率方程式提出补充， 进一步提出了液相色谱速率理论方程式。,2.4 .1 紊流模型（Random

12、Walk）,紊流模型的理论要点： 组分分子随流动相通过色谱床时，沿着流 动相的方向在一维空间内进行无规则的运动， 组分分子随机的向前走。,平均步长,（相当于塔板高度H）,行走步数,（相当于理论塔板数）,行走距离L（相当于色谱柱长）,多个分子如此随机行走，导致谱带扩宽， 扩宽的程度可用正态分布标准偏差 来表示：,谱带宽度,色谱柱长可以理解为步数,和平均步长,的乘积。令步长,，步数,，则：,H的物理意义：单位柱长色谱峰展宽的程度,色谱柱总塔板高度 等于各个独立影响因素 对板高贡献之和：,2.4.2 广范围的Van Deemter方程式,1.涡流扩散（eddy diffusion） 涡流扩散纯属流动

13、状况造成 涡流扩散动画 单位柱长对峰宽的影响为 式中： 填充颗粒的平均直径 填充因子，与dp粒度范围和填充情况有关 高效率柱： 采用200-400目粒度范围颗粒,2.纵向扩散 纵向扩散是分子的无规则热运动引起的，所以也称为分子扩散。 分子扩散动画 式中： 弯曲因子，也称为障碍因子，与填充材料的几何形状有关。 Dm组分在流动相中的扩散系数，与组分的性质、柱温、压 力、流动相性质有关。 流动相的平均线速度 LC：液体没有压缩性，柱内线速度是均匀的 GC：气体可压缩，柱内压力从入口到出口递降，载气线速度从入口到出口递升。 uo ：柱出口流速,3.固定相中的传质阻力(Resistance to mas

14、s tramsfer in stationary phose) 溶质由流动相扩散到固定相、在固定相中溶质要达到平衡时所遇到的阻力。 峰扩展原因：同一组分的分子进出固定相的速度不同 液相固定相：由于分子扩散到固定相不同的深度 吸附色谱：吸附剂表面的活性不同,式中： 构型因子，取决于固定相的构型。 均匀液膜： 离子交换树脂 固定相（液膜）的平均厚度。 小，有利于迅速建立平衡，柱效高 过小 最大允许进样量小 载体表面的吸附中心暴露，导致峰拖尾 溶质在固定相中的扩散系数,，纸：,3.流动相中的传质阻力（Resistamce to mass tramsfer in mobile phase) 组分从流动

15、相的主体扩散到流动相与固定相的界面进行质量交换，妨碍这一扩散过程的阻力称为流动相传质阻力,a.流动的流动相中的传质阻力,不同分子与固定相表面的距离不一， 到达表面所需要的时间不同。,对于气相填充柱色谱：,对于液相色谱：,式中：,- 无纲量常数，或称为柱因子,b.停滞流动相中的传质阻力 存在于颗粒内部孔隙中的流动相，不随主体流动，故称为停滞流动相,式中：,- 与颗粒微孔中被流动相所占据部分 的分数及与容量因子有关的常数,联合上述四项影响色谱区带宽化的因素：,对于气液色谱，,不存在，则：,GC：溶质在气相流动相中传质快，流动相 传质阻力可以忽略，一般采用只有三项的简化VanDeamter方程式：,

16、上两式均称为速率理论方程式，可以简写为,2.4.3 速率理论方程式的偶合式,Giddings以严格的科学方法证明影响塔板高度的各种因素不是独立，而是相互关联的。,涡流扩散和流动相传质效应相互偶合形成 偶合涡流扩散项Hem。,2.4.4 速率理论方程式的讨论,（1）流速对塔板高度H的影响,曲线的最低点H最小，以Hmin表示，柱效能 最高。该点对应的流速称为最佳流速：,GC曲线与LC曲线不同的原因：,Dm大，当,低时，分子扩散项,影响显著。,(2)固定相颗粒,的影响,2.5影响谱带扩宽的其他因素,1.非线性色谱 速率理论假定分配等温线是线性的，在实际工作中，经常遇到的是非线性等温线。,2.活性中心

17、的影响 载体或吸附剂表面的活性中心对组分的吸附力太强，使组分迟迟不得释放而造成拖尾。 解决办法： 将载体进行预处理，去除表面的活性中心； 在LC中，在流动相中加入缓和剂。,3.柱外效应 进样的方式和进样技术，以及进样器、检测器、连接管的死体积造成的谱带扩宽，称为柱外效应。 柱外效应常用柱外效应引起峰体积的相对增大值作为度量指标： 峰体积,柱内宽化服从速率理论方程 柱外某连接管溶质的宽化为： 式中， d:连接管内径(0.25-0.3mm) L:连接管的长度 流动相体积流速,死体积愈小，柱外宽化愈小，一般控制不超过 总宽化的10%。,影响谱带扩展的各种因素为：,四种动力学因素,涡流系数,纵向分子扩

18、散,固定相传质阻力,流动相传质阻力,其他,非线性等温,活性中心,死体积,进样管 连接管 检测器,其他,进样技术 气化温度,2.6 分离度及其影响因素,2.6.1 分离度的定义,色谱分离的三种情况,实现分离的条件,峰间距：,峰宽：柱效能增大 ，峰宽减小,全面反映两峰分离程度的参数分离度R,相邻两峰保留时间之差与两组分色谱峰的 峰底宽度之和的一半的比值称为分离度R,对于对称的高斯峰,R=0.8时，分离程度89,一般采用R=1.5作为相邻两峰完全分离的标志。,2.6.2 基本分离方程式,上式称为基本分离方程式，是色谱分析 中最重要的方程式之一，可以计算给定体系 所能达到的分离度和达到某一分离度所需 的色谱柱长。,2.6.3 影响分离度的因素,（1）色谱柱效n,增加n的方法： 降低H，制备性能优良的柱子，在最优化的 条件下操作。 增加柱长： 若系统压力不变，则必须降低流速， 若分析时间不变，则必须增大柱压，对设备要求提高,（2）相对保留值a,增大，柱选择性提高，R增大。,从1.01,1.1，增加9。R增加9倍。,从1.5,2.0，增加33。R增加1.5倍。,1，改变，R增大。,较大时，对R的影响小，1-2已足够。,若要达到一定的分离度，在k不变的情况下，的微小增加，将使n显著 下降。,R,n,改变的方法,GC：固定相，柱温,LC：固定相，流动相,（3）分配比 k,即分离度正