卫生部课题申请技巧 PPT课件

1、苏景宽，国家自然科学基金委医学教育司，2003年1月，1，第一部分：基金委主持项目评估的基本程序和重要环节，2，初步评审：由各学科部门组织实施。申请人无资格申请或违反相关规定的；手续不全或者申请不符合要求的；内容不符合资助范围或超出资助能力的；申请人过去资助的项目没有得到很好的实施。3、查重：由基金委信息中心组织实施。高等职业教育的申请和承诺(包括参与)不超过3项。在职研究生不是有限申请的条件，只能申请表面项目；申请人只能同时申请一个项目，每个项目申请人限一人；本年度内，高职申请者申请并承担的研究领域项目不超过两个；没有受过高等职业教育的申请人申请并负责的研究项目不超过一个；青年基金只能得到一

2、笔赠款。同行评议(初审):由国家自然科学基金委各学科部门组织实施。基本程序：为每个申请选择同行评审专家(5名)；请同行评议：对项目进行定性和定量评估；收回评估卡；定量部分的计算机解释、评分和分类；根据学科支持的130个项目数量，确定第二轮评估项目。5，由专家评审组或专业委员会评审(二审)。主要是对推荐项目进行初审，筛选出30个。再次审核第二次试验会议确定的资助项目；进一步核对重复项目；过去承担的项目是否按时完成；是否违反基金会委员会的相关申请规定。基金委员会委员会进行了审议。发布批准和不批准通知。第二部分，国家自然科学基金申请表的撰写。摘要(限400字)包括：研究方法、内容、目标、科学意义等。

3、如：“用方法(手段)研究、探索/证明问题对于阐明机理、揭示规律、提供思路奠定基础具有重要意义”，8通过将基因转染入晶状体上皮细胞体内和体外培养，观察细胞形态、增殖和凋亡、骨架蛋白和晶状体蛋白的变化，并研究基因的功能。从晶状体上皮细胞的角度阐明老年性白内障的分子生物学机制，为白内障的防治提供新的思路和理论依据。在基础研究的基础上，着眼于国际科学发展趋势，讨论项目和应用基础研究的科学意义，着眼于学科前沿，围绕国民经济和社会发展中的重大科技问题，从研究领域(疾病预防与控制)的研究方向出发，总结分析本项目需要解决的问题，提出思路，从研究领域(疾病书写方法：从疾病入手)出发，简述其特点、危害、目前主要治

4、疗方法和存在的问题。简要分析了该病的发病机理和主要研究热点，引出了目前存在的主要问题，即本项目需要解决的问题，并以此为切入点提出了设想，阐述了如果达到预期目标，对该病乃至相关疾病的防治具有理论意义和临床价值。老年性白内障是一种年龄相关性疾病，其发病率随年龄增长而增加。特别是随着人类的老龄化，白内障患者的数量将继续增加。目前，它是人类的第一种致盲疾病。目前，治疗白内障的唯一有效方法是摘除混浊晶状体并植入人工晶状体。尽管手术后患者可以恢复良好的视力，但不可避免的术后并发症以及手术设备和材料成本高昂，用于白内障治疗的资金已经成为世界各国，包括富裕发达国家的严重医疗负担。最近的一项调查显示，如果老年性

5、白内障的发病时间推迟10年，白内障手术的次数将减少45%。因此，一些学者认为通过预防白内障或延缓其发展来征服白内障已经成为一个全球性的社会和社会经济问题。13，但目前我们对老年性白内障的发病机制还不是很清楚。多年来，许多学者已经证实晶状体上皮细胞在老年性白内障的发生发展中起着重要作用，但对其进一步的基因调控却知之甚少。如果从与老年性白内障晶状体上皮细胞变化相关的基因入手，研究基因的生物学功能，就有可能掌握导致白内障发生发展的主要环节。因此，本研究拟利用改良消减杂交和基因芯片技术的准确性、全面性和快速性，以晶状体上皮细胞为研究对象，一次性筛选出老年性白内障的所有差异表达基因，然后筛选出白内障相关

6、基因，并重点研究其功能，从基因水平阐明白内障的发病机制，为白内障的防治提供新的思路和理论依据。国内外现状分析中存在一些问题：文献综述不足，对国内外现状缺乏真正的了解，提出的问题已被他人解决-低水平重复。不熟悉研究方法，简单移植或夸大其功能，缺乏实际应用的可行性，无法达到预期目标。-现有方法和掌握这些方法的人的结合；该方法的理论可行性和实践可行性的结合。国内外现状简单罗列，缺乏归纳分析，缺乏逻辑性和针对性，总结和表达不足。写作方法：关注这个应用程序的主题。1.从疾病的角度，简要论述了国内外的研究成果，并介绍了当前的研究热点方向。2.从研究方向出发，详细分析了国内外在该方向的研究进展，引出了阐明疾

7、病发病机理或发明新的治疗方法等关键问题。3.围绕关键问题，详细讨论了国内外以往的研究成果、现状和未来发展趋势。经过综合分析，提出了尚未解决的问题。16、4。介绍和分析拟采用的技术方法。应简要介绍成熟的方法，重点介绍可应用于本研究的基础。应详细介绍新方法的原理，并阐明可用于本研究的理论基础和实验基础。需要特别注意的问题：项目中使用的技术方法的原理、过程和实际应用中可能出现的问题必须非常清楚，不能简单移植。例如，单链抗体的功能基团在理论上是可以融合的，但存在“表达载体的活性、选择和纯化”等问题。5.提出本项目的研究思路。17.白内障的防治必须着眼于其发病的主要环节。多年来，国内外学者从不同角度探讨

8、了白内障的发病机制。就致病环境因素而言，氧化因素、紫外线辐射、晶状体周围环境中离子浓度的变化以及某些生长因子和细胞因子的变化都与老年性白内障的发生有关。就研究部位而言，晶状体皮质和核的蛋白质变化以及晶状体纤维的变化与白内障的形成有关，而位于晶状体前囊下单层的晶状体上皮细胞在白内障形成中的变化更引人关注。由于晶状体上皮细胞是晶状体中唯一具有有丝分裂活性且数量相对稳定的细胞，因此它们分裂并分化为晶状体成纤维细胞，并产生晶体蛋白，该晶体蛋白永不停止生长并形成晶状体的均匀对称结构，这在保持晶状体的透明度方面起着重要作用。此外，晶状体上皮细胞在晶状体早期也受到外部刺激的影响。研究证实，老年性白内障的晶状

9、体上皮细胞也发生变性，细胞膜通透性增加，胞内酶活性改变，细胞数量减少体外实验也证实了多种因素(H2O2、紫外线B、晶体蛋白自身抗体)诱导的晶状体上皮损伤是晶状体混浊的主要环节。因此，从晶状体上皮细胞的变化探讨白内障的病因，有可能把握揭示白内障发病机理的主要环节。晶体上皮细胞变化的基因调控机制是问题的关键，也是有待进一步研究的问题。白内障的形成与晶状体老化密切相关，是晶状体老化的极端表现。晶状体老化是多种因素相互作用的结果，包括基因和非基因随机变化的积累，以及组织特异性基因表达的程序化和非随机变化。目前，国内外对白内障相关基因的研究主要包括以下三个方面：21。首先，研究晶状体白内障模型和体外培养

10、的上皮细胞。晶状体上皮细胞是紫外线辐射诱发白内障的主要靶细胞，其钠钾三磷酸腺苷酶活性和蛋白质合成与分泌增加。上皮细胞凋亡增加，其中c-fos基因表达增加；还有组蛋白H4和H3的低表达和蛋白酶、肌动蛋白和肌动蛋白基因9-12的高表达。Carper等13利用逆转录聚合酶链式反应差异显示技术研究H2O2诱导的晶状体上皮细胞基因差异表达。结果表明，转谷氨酰胺酶基因表达降低，核蛋白、选择性剪接因子2和-三羟基异丁酰辅酶a水解酶基因表达增加。第二是利用转基因动物的研究。含波形蛋白基因和杂交中间纤维蛋白基因的转基因小鼠出现白内障，且白内障随着小鼠年龄的增长而加重。晶状体改变的共同特征是晶状体成纤维细胞的分化

11、受到抑制。14，15。龚等16报道晶状体中含有3(3)连接蛋白基因的敲除小鼠在晶状体形成和成纤维细胞分化的早期不受影响，随后出现与晶状体蛋白水解有关的核性白内障。尽管体外实验和白内障转基因小鼠表明一些基因变化与白内障有关，但没有进一步的报道表明这些基因是否与老年性白内障的形成有关。三是对人老年性白内障晶状体上皮细胞的研究。对Lee17的逆转录聚合酶链反应研究表明，前极性白内障和核性白内障上皮细胞中纤维连接蛋白、型胶原纤维、平滑肌蛋白、TGF-1、TGF-2、TGF型受体和结缔组织生长因子的基因表达存在差异。坎特罗等人18使用逆转录聚合酶链反应-二磷酸脱氢酶研究了老年性白内障和正常晶状体上皮细胞

12、之间的基因差异表达。初步结果表明，老年性白内障有3个高表达基因和12个低表达基因。然而，就双向聚合酶链反应技术而言，在实验中很难解决假阴性、假阳性和克隆全长基因的问题。以上三项研究均取得了不同程度的研究成果，但由于当时技术条件的限制，白内障相关基因及其功能无法完全阐明。发现白内障过程中晶状体上皮细胞与正常晶状体上皮细胞之间差异表达的基因可能揭示白内障的发病机制。消减杂交是寻找差异表达基因的经典方法，但实验操作复杂。改进的抑制消减杂交(SSH)是Diatchenko等人在1996年建立的一种方法，它简化了实验操作，但仍存在许多问题。我校生物化学教研室建立了改良的消减杂交技术19和20，其特点是简

13、单、方便、能获得靶细胞特异表达的全长基因和有效分离低丰度基因。26，该方法的创始人从人牙髓细胞脂多糖刺激前后的差异表达基因中克隆了脂多糖刺激后特异性表达的基因，其中5个为新基因。同样，该方法可以快速有效地获得白内障晶状体上皮细胞与正常晶状体上皮细胞之间的差异表达基因，并克隆到全长cDNA中，为进一步的结构和功能研究奠定了基础。随着基因芯片技术的出现，检测差异表达基因和未知分子变得更快、更准确、更有效。基因芯片是在1996年提出并发展起来的。这项技术将数千个脱氧核糖核酸探针集中在一个1厘米见方的基底上。基于碱基互补的原理，DNA探针中已知的碱基序列与待测的未知DNA分子杂交，然后用标记分子标记该

14、杂交体。通过自动读取设备分析杂交结果，从而可以对检测到的基因进行定性、定量和结构分析，以确定未知的DNA分子。由于目前还没有现成的用于白内障研究的基因芯片，根据本研究的需要，我们建立了所有差异表达基因的cDNA文库，然后利用基因芯片技术制备基因芯片，从而在多个样本中检测白内障晶体上皮细胞与正常晶状体上皮细胞差异表达的潜在原因，进一步筛选出可能含有已知基因或未知基因的白内障特异性基因。通过以上两种技术的有机结合，我们可以更快速、有效、准确地获得白内障相关基因。综上所述，分子生物学技术的发展为研究白内障发育过程中的功能基因和特异性调控基因提供了有利的武器。本项目从晶状体上皮细胞入手，通过改良消减杂

15、交和基因芯片技术系统研究白内障相关基因，利用体外培养细胞和体内晶状体上皮细胞的基因转染，探讨其在晶状体上皮细胞变化和白内障形成中的作用，以期阐明白内障晶状体上皮细胞变化的分子生物学机制，为白内障的防治提供新的思路和理论依据。注意事项，注意逻辑和层次，随时提问。文字应该精心制作以避免虚伪。参考资料必须提供作者的全名和来源。必须引用2002年甚至2003年的参考文献。应注意参考国内知名专家的作品。文献综述不能回避国内外的最新研究进展。研究方案，1 .研究目标存在的问题：写作要求过大：目标有限，与研究内容相对应，如：探索问题、理清关系、揭示规律、理清原则(机制)、确立方法等。32岁。研究目的：筛选老年性白内障相关基因，明确部分。研究内容：存在问题：内容太多，难以完成一个研究周期；内容零散，研究目标不明确。写作要求：内容应适当，以确保研究周期的完成；目标互补，服务于研究目标。长度应适中，并注意与技术路线的差异。确定研究目标和内容的依据：回答科学问题；根据研究周期和资助强度。研究内容：(1)白内障相关基因的筛选：利用改进的消减杂交技术，获得了人老年性白内障晶状体上皮细胞和正常晶状体上皮细胞的差异表达基因片段，并建立了cDNA文库。制备差异表达基因的基因芯片，利用基因芯片技术从多份标本的老年性白内障晶状体上皮细胞中筛选出白内障相关基因