抗生素生产工艺.ppt

1、1,抗生素生产工艺,抗生素是青霉素、链霉素、红霉素等一类化学物质的总称 是生物在其生产活动过程中所产生，并能在低微浓度下有选择性地抑制或杀灭其他微生物或肿瘤细胞的有机物。具有抗菌、抗肿瘤、杀虫除草、抑制生物体中某些酶类的作用，有些还具有某些药理活性，如强力霉素镇咳；新霉素降胆固醇,教材P218,2,抗生素的生产方法,生产主要采用微生物发酵法，属于次级代谢产物，少数如氯霉素、磷霉素亦可用化学合成法生产,3,半合成抗生素,将生物合成法制得的抗生素用化学或生化方法引入特定的功能基团进行分子结构改造而制成各种衍生物。如氨苄青霉素(ampicillin)就是半合成青霉素的一种。 增强抗菌力 扩大抗菌谱

2、对耐药菌有效 便于口服 减低毒副作用 改善药理性质、提高生物有效性,教材P218,4,抗生素的生物来源,放线菌：链霉菌、诺卡氏菌属、小单孢菌属 真菌：青霉菌属、头孢菌属、担子菌 细菌：多粘杆菌、枯草杆菌、芽孢杆菌 植物或动物：蒜蒜素；动物脏器鱼素,教材P219,5,抗生素化学结构的分类,-内酰胺类：青霉素类、头孢菌素类，包含一个四元内酰胺环 氨基糖苷类：链霉素、庆大霉素，既含有氨基糖苷，也含有氨基环醇 大环内酯类：红霉素、麦迪加霉素，含有一个大环内酯作配糖体，以苷键和1-3个分子的糖相连 四环类：四环素、土霉素，以四并苯为母核 多肽类：多粘菌素、杆菌肽，含有多种氨基酸，经肽键缩合成线状、环状或

3、带侧链的环状多肽,6,抗生素的作用,广谱抗生素：氨苄青霉素 抗革兰氏阳性菌抗生素：青霉素 抗革兰氏阴性菌抗生素：链霉素 抗真菌抗生素：制霉菌素 抗病毒抗生素：四环类抗生素 抗癌抗生素：阿霉素,7,抗生素的作用机制,抑制细胞壁合成：青霉素、头孢菌素 影响细胞膜功能：多烯类抗生素 抑制病原菌蛋白质合成：四环素 抑制核酸合成：丝裂霉素C 抑制生物能作用：抗霉素,8,我国抗生素工业的发展,我国1953年设计制造了4个5吨发酵罐，建立上海第三制药厂，开始生产青霉素 1957年建立华北制药厂 经40多年来发展，国外有的基本抗生素品种我国都有生产，并已研制出国外没有的抗生素创新霉素等 截止1996年上半年，

4、总计127个品种生产，总产量近几年3万吨，约占世界抗生素产量的1/4。 农用抗生素研究生产也获得了可喜的成绩，灭瘟素、春日霉素和有效霉素等。,9,抗生素的应用,医用抗生素，青霉素钾、钠等可控制金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌等引起的严重感染（败血症、肺炎、脑膜炎等），半合成青霉素和头孢菌素用于对付耐药性金黄色葡萄球菌，链霉素抗G-和结核杆菌 农用抗生素，作用强、剂量小，且不易引起环境污染,10,抗生素剂量表示法,使用剂量不足，达不到抑菌能力，使用剂量过高，会产生毒副作用，且引起病原菌的耐药性。 故常用效价单位作为衡量抗生素的一尺度。 一个青霉素效价单位在50ml肉汤培养基中完全抑制金黄色葡萄球菌标准

5、菌株发育的最小青霉素剂量 一个链霉素效价单位1ml肉汤培养基中完全抑制E.Coli标准菌株发育的最小链霉素剂量 一个制霉菌素效价单位1ml肉汤培养基中完全抑制某种酵母标准菌株发育的最小制霉霉素剂量,教材P220,11,抗生素-次级代谢产物,抗生素是最典型、最著名的次级代谢产物 次级代谢产物又叫做分化代谢物，是在分批培养的分化期（生产期）形成的，只在产生菌的比生长速率降低时才合成,12,抗生素的生物合成,将养分吸收到细胞内，并把它转化为主干代谢途径的中间体 经过初级代谢途径的几步以后歧向专门抗生素合成的途径,13,与抗生素合成有关的初级代谢,脂肪酸代谢 氨基酸代谢 糖代谢 嘌呤和嘧啶代谢 芳香族

6、化合物的生物合成 从C1库来的甲基,14,抗生素的组成,许多抗生素利用氨基酸作为建材 有些抗生素纯粹以氨基酸为组份 一些抗生素既有氨基酸，又与其他代谢物（糖、脂肪酸）结合,15,与青霉素合成相关的氨基酸,赖氨酸 半胱氨酸 缬氨酸,16,抗生素生产的工艺过程,菌种 孢子制备 种子制备 发酵 发酵液预处理 提取及精制 成品包装,17,菌 种,最早发现产生青霉素的原始菌种是点青霉，生产能力低，表面培养只有几十个单位；后来找到适合深层培养的产黄青霉菌，现在工业生产中常用菌种都是该菌的变种，发酵单位可达5-8万单位。 常用菌株有RA18(前体苯乙酸，最佳浓度1.0-1.12g/L)和国产399(前体苯乙

7、酰胺，最佳浓度0.3g/L)、IAP-10(Q-176)、IANP8007、IANP8009、IFFI4014等。 产生菌在固体培养基上开始生长时，孢子先胀大，长出芽管并急速伸长，形成隔膜，繁殖成菌丝，产生复杂的分支，交织成网状而成菌落。分生孢子呈黄绿色、绿色或蓝绿色，衰老后变为黄棕至灰色，有圆、椭圆和圆柱形。,18,孢子制备,将保藏的处于休眠状态的孢子，接种至固体斜面培养基，在一定温度下培养5-7或7日以上 进一步用扁瓶在固体培养基上扩大培养,19,种子制备,目的使孢子发芽、繁殖以获得足够数量的菌丝，并接种到发酵罐中 摇瓶或直接将孢子接入种子罐逐级放大培养 种子培养定时取样作无菌试验，观察菌

8、丝形态，测定种子液中发酵单位和进行生化分析 种子级数：通常2级,20,培养基的配制,碳源 氮源 无机盐类 前体,21,碳 源,供给菌种生命活动所需能量，构成菌体细胞及代谢产物 参与抗生素的生物合成 常用碳源：淀粉、葡萄糖及油脂,22,氮 源,构成菌体细胞物质和含氮代谢物 参与含氮抗生素合成 有机氮源 无机氮源,23,无机盐和微量元素,同其他微生物,24,前 体,菌体利用其构成抗生素分子中的一部分而其本身没有显著改变的物质 一定条件下控制菌体合成抗生素的方向并增加抗生素的产量 如苯乙酸成苯乙酰胺可用作为青霉素发酵的前体。丙醇或丙酸可作为红毒素发酵的前体。前体的加入量应当适度。如过量则往往前体有毒

9、性，并增加了生产成本。如不足，则发酵单位降低。,25,发 酵,目的是使微生物大量分泌抗生素 接种10% 通气 搅拌 控制罐温 消泡 控制pH 定时采样进行生化分析、镜检，测定菌体浓度、残糖量、抗生素含量等,26,发酵液的过滤和预处理,分离菌丝、去除杂质 预处理：去除高价无机离子和蛋白质 过滤：去除固形物及菌体,27,发酵液的预处理,草酸及磷酸去除高价离子钙、镁，还能促使蛋白质凝固 黄血盐有利于去除铁离子 硫酸锌有利于凝固蛋白质 等电点法、加热法、絮凝法去除蛋白,28,发酵液的过滤,板框过滤机 鼓式真空过滤机 自动出渣离心机 倾析器,29,抗生素的提取,溶媒萃取法 离子交换法 直接沉淀法,30,

10、抗生素的精制,药品生产符合GMP规定 脱色及去除热原质 结晶和重结晶,31,脱 色,色素是发酵过程中产生的代谢产物，与菌种及发酵条件有关 活性炭脱色,32,热原质,在生产过程中由于被污染后由杂菌所产生的一种内毒素，G-产生的热原反应高于G+，是多糖磷类脂质和蛋白质的结合体，引起恶寒高热，甚至休克 活性炭吸附 超滤去除,33,进一步精制,结晶与重结晶 共沸蒸馏法 柱层析法 中间盐转移法 分子筛,34,青霉素的生产工艺,菌种：产黄青霉素 （Pen chrysogenum） 生产能力达到30000-60000/mL,35,世界范围内，1997年青霉素原料产量达3.7万吨，其中包括青霉素G 2.4万吨

11、和青霉素V 1.3万吨。目前世界青霉素年需求量为3.8万吨，但直接作为注射剂使用的青霉素G和作为口服剂使用的青霉素V仅占全部青霉素产品的20%，除了另外3%5%作为兽药或饲料添加剂使用外，大部分青霉素是作为制备6-氨基青霉素烷、7-氨基脱乙酰氧基头孢烯酸或氯亚甲基头孢烯母核的原料，通过这些母核中间体转化成高附加值产品推向市场。据估计，在世界范围内目前对6-氨基青霉素烷的需求量约为25800吨，到2005年达到32800吨；对7-氨基脱乙酰氧基头孢烯酸的需求量约为6000吨，到2005年为7000吨。,36,2005年，世界基本药物中，仅羟氨苄青霉素、氨苄青霉素和头孢氨苄3个品种的世界需求量达1

12、7800吨。上述三种产品占抗感染药物原料药的78%，用于生产这些半合成产品所需消耗的青霉素约占全部产量的3/4。 据国际抗生素协会估计，本世纪初期，国际青霉素原料药市场仍将维持目前的价格，而不可能回到八十年代初期的每公斤2736美元高价位。但青霉素及氨苄青霉素粉针因受成本影响，2001年的销售价格已经回升。,37,经过国家一系列政策、法规的出台，以及整顿国内医药市场，促进了医药市场的规范化，使大企业的规模优势、品牌优势更加突出，一些中小企业在竞争逐步被淘汰，市场份额逐步向优势企业集中。据统计，青霉素G钠原料，华药、石家庄制药、鲁抗、哈药四家所占份额已由1999年的89%上升到2000年一季度的

13、91.2%。 目前中国青霉素年发酵能力在1500吨以上，其中，华北制药3200吨，哈药集团为2100吨，山东鲁抗为1290吨，这三大青霉素生产企业年发酵能力为6590吨，年发酵能力超过1000吨的企业还有四川制药厂、河北制药集团和张家口制药总厂。,38,中国目前是世界上最大青霉素生产国，青霉素原料主要出口市场是：印度、韩国、日本、台湾、德国、荷兰、爱尔兰、法国、香港和美国，这十大市场合计占中国总出口量的82%。 中国青霉素原料在世界具有竞争力，但需积极探讨加入WTO所带来的影响。90年代，青霉素价格出现两次暴跌，1996年1997年青霉素第二轮降价迫使西方生产商退出市场，西方公司未来将转向生产

14、青霉素干粉原料为主。因为多数中国和印度的生产商受到政府的支持和补贴，使他们度过市场动荡这一难关。据估计，中国和印度生产的青霉素原料目前占世界市场的2530%，印度成为中国出口青霉素的最大竞争对手。因此，未来的青霉素原料市场，将形成由吉斯特、Antibioticos（安替）、施贵宝和史克必成4大公司与中国、印度相互竞争的局面。,39,中国的青霉素生产规模在1996年得到迅速扩展，当时全球青霉素原料药年产销量达4万吨左右，其中中国的青霉素在国际市场的份额占到30%，且出口量猛增。 1999年，中国大力整顿医药市场，供求关系得到改善，医药市场逐渐规范，中国青霉素工业钾盐的生产能力已占世界生产能力40

15、000吨的40%，实际产量占世界的35.29%，特别是进入2000年，中国的原料药产量中有七种青霉素系列产品均呈现增长趋势，其中哌拉西林增长了267%，以6-APA为中间体的系列产品阿莫西林增长69%，产量近2000吨。,40,华北制药厂青霉素发酵总容积居世界首位1994年9月21日，华北制药厂“千吨青霉素改造工程”投产，它标志着华北制药厂青霉素发酵总容积居世界首位，成为世界上最大的青霉素生产厂家之一。该工程自动化程度较高，发酵、提炼工艺全部由微机自动控制，其青霉素产量占全国总产量的1/2。,41,华药集团已将其持有的5820万股华北制药国有股以3.55元/股的价格转让给荷兰DSM（帝斯曼）公

16、司，这个价格高于公司的每股净资产1.88元，也高于公司目前的流通股价2.28元。 DSM于1902年由荷兰政府成立,在全球范围经营生命科学和营养品、性能材料及工业化学品。在全世界40多个国家拥有250多家机构和生产基地。2003年其全球销售网络销售收入约80亿欧元,为 全球500强之一。DSM是世界上最大的抗生素和维生素原料制造商，拥有国际最先进的青霉素生产技术。通过DSM参股并进行战略合作，华北制药有望获得更强的业务开发能力和市场开拓能力，如果DSM将最新的青霉素发酵技术带入华药，公司青霉素及相关产品成本将下降20%，毛利率提高30个百分点；同时资产负债将得到改善，财务负担将全面减轻。更重要

17、的是，与DSM联手，公司的维生素市场地位将明显提高，并消除市场竞争带来的收益波动。,42,43,44,工艺流程,冷冻管 斜面母瓶 大米孢子 一级种子罐 二级种子罐 发酵罐 放罐 提炼,孢子培养,25C,6-7d,孢子培养,25C,6-7d,发 酵,25C,40-45d 1:2VVM,25C,40-45d 1:1.5VVM,种子培养,种子培养,22-26C,6-7d 1:1-0.8VVM,冷至15 C,教材P225-226,VVM:每分钟通气量和发酵液体积之比 例如:通气量2400m3/h,发酵液体积20m3,则通风比(也称气比)为2400/60/20=1:0.5,45,培养基,碳源：利用多种碳

18、源和乳糖、蔗糖、葡萄糖等。普遍采用淀粉经酶水解的葡萄糖糖化液进行流加 氮源：可选用玉米浆、花生饼粉、精制棉籽饼粉或麸质粉，并补加无机氮源 前体：为生物合成含有苄基基团的青霉素G，在发酵中加入前体如苯乙酸或苯乙酰胺，加入量不能大于0.1%，采用多次加入方式 无机盐：硫、磷、钙、镁、钾等盐类,46,青霉素生产菌生长发育阶段,I期 分生孢子发芽 II期 菌丝繁殖 III期 形成脂肪粒，积累贮藏物 IV期 脂肪粒减少，形成中、小空泡 V期 形成大空泡，脂肪粒消失 VI期 细胞内看不到颗粒，个别细胞出现自溶,47,青霉素生产菌生长发育阶段,I-IV期为菌丝生长期，产青霉素较少，菌丝浓度增加很多 III期

19、适于作种子 IV-V期青霉素分泌期，菌丝生长趋势减弱，大量产生青霉素 VI期菌丝自溶期,48,发酵工艺控制,温度控制：前期25-26C，后期23 C pH控制：一般为6.4-6.6，加酸加碱及加葡萄糖控制 通气：一般为1：0.8VVM 搅拌：要求发酵液中溶解氧量不低于30%。 泡沫与消沫：少量多次加入消沫剂，在发酵前期不宜多用,49,发酵工艺控制,加糖控制：根据残糖量与发酵过程中的pH来控制，也可根据排气中CO2与O2量来控制 补氮：发酵液氨氮控制在0.01-0.05% 加前体：残余苯乙酰胺浓度控制在0.05-0.08%,50,51,52,53,摇 瓶 发 酵 Shake-flask,装液量：

20、10% (250ml) 间歇培养 温控受限制 代谢碳水化合物慢 常压 缓冲液控制pH 在线取样难 容量减少 瓶壁上结垢 无需消泡 搅拌受限制 无法控制溶解氧,10-100,000升容量 间歇和补料培养 连续控制：pH，温度 需要铵盐或氨气 2 大气压 无需缓冲液 在线取样易 补料,容量增加 生长均匀一致 需消泡 多种搅拌 控制溶解氧:通气,加压,搅 拌 罐 发 酵 Stirred tank,54,发酵生产原料 Materials for Fermentation,Carbon source: Beet & cane molasses Glucose, lactose, starch Ethan

21、ol, methanol Glycerol Maltose syrup, corn syrup Cottonseed oil, peanut oil, soy oil Lard oil Methyl oleate Tallow,碳源: 甜菜和甘蔗糖蜜 葡萄糖，乳糖，淀粉 乙醇，甲醇 甘油 麦芽糖浆，玉米糖浆 绵籽油，花生油，豆油 猪油 油酸甲酯 油脂,55,氮源: 绵籽粉 玉米粉和玉米浸出液 大豆粉和大豆面 花生粉 菜籽粉 牛血，酪蛋白水解液 乳清 鱼粉 酵母 酵母膏 肉粉和骨粉,Nitrogen source: Cotton seed meal Corn meal & steep liquo

22、r Soybean meal & flour Peanut meal Rapeseed meal Beef blood, Casein hydrolysate Whey Fish meal Whole yeast Yeast extract Meat & bone meal,发酵生产原料 Materials for Fermentation,56,过 滤,鼓式真空过滤器,57,提 炼,溶媒萃取法：将发酵滤液酸化至pH2，后加相当于发酵滤液体积1/3的醋酸丁酯，混合后以碟片式离心机分离；然后以1.3-1.9%NaHCO3在pH6.8-7.1条件下将青霉素提取到缓冲液中，再调pH2，将青霉素从缓冲

23、液转入到醋酸丁酯溶液中,58,脱 色,在提取液中加活性炭150-300g/10亿单位，进行脱 色、过滤,59,共沸蒸馏,将萃取液以0.5mol/L NaOH液萃取，调pH至6.4-6.8，加3-4倍体积丁醇，在16-26C，5mmHgG下真空蒸馏，将水与丁醇共沸物蒸出，并随时补加丁醇。当浓缩到原来水浓缩液体积、蒸出馏分中含水达2-4%时，停止蒸馏，青霉素钠盐结晶析出，过滤，洗涤，干燥得成品。,60,土霉素生产,菌种: 龟裂链霉菌 （Streptomyces Rimosus） 菌落灰白色，后期生皱褶，呈龟裂状。菌丝呈树枝状分枝，白色，孢子灰白色、柱形,61,生产工艺流程,砂土管孢子 斜面孢子 一

24、级种子 二级种子 发酵 提取,37C,4-5天,320.5C,310.5C,30-32h,24-26h,32C-310.5C- 32C,160h,62,砂土管,黄沙：土 = 1：1（沙和土都经处理，水洗至中性，烘干，研细，过筛） 每管装一定量的砂土，塞好棉塞包好，121高压蒸汽灭菌后再用160 干热灭菌2h 每支砂土管加0.3mL孢子悬浮液，包好，放入装有干燥剂的真空干燥剂内抽干6-12 h，轻轻敲打使其均匀。完后，放入装有干燥剂的密闭瓶内，0-4贮藏,63,斜面,250 ml茄子瓶 麸皮4%，麦粉2%，琼脂2%,64,一级种子 400-500L 二级种子 4m3（搅拌）,65,发 酵,15%

25、接种量 培养基： 碳源：淀粉 经-淀粉酶液化 氮源：黄豆饼粉，硫铵 无机盐：KH2PO4，NaCl ，CaCO3，CoCl2 生长因子：酵母粉，玉米浆,66,采用中间补料，延长抗生素分泌期，是提高抗生素产量的重要方法。土毒素生产过程采用补糖与补氨，以保证其在分泌期有足够多而不过多的养料。 总糖 前期 0-80 h 6.5-8% 中期 80-120 h 5-6.5 % 后期120-140 h 4-5 % 末期 140 h后 4% 放罐残糖3%以下，放罐前24 h不补料,67,补氨同时为调pH，pH=6.0-6.3，放罐前8 h停止通氨，整个过程通氨水总量350-400升,68,预处理,土霉素能和

26、发酵液中钙盐、镁盐 ，某些有机胺、蛋白质形成不溶性化合物，积聚在体内。 预处理目的为： 1）使部分土霉素溶液解出来 2）蛋白质（菌丝）沉淀 3）Fe3+沉淀,69,提取工艺,发酵液 酸化液 稀释液 净化液,加草酸及盐酸酸化pH1.7,并加适量黄血盐，搅30,(26000 r/ml),稀释到7500-8000 r/ml,加黄血盐及硫酸锌,净 化,板框过滤,滤液（土霉素草酸）,滤渣（草酸钙、蛋白质、菌体、 铁络合物）,70,滤液 脱色液 土霉素 + 草酸 湿晶体 成品,板框过滤 离心,氨水调pH4.1-4.7 搅50,气流干燥 80-90C,离子交换 122#,71,实例青霉素发酵中生物量下降,在青霉素发酵中，移种后30小时之前都比较正常，菌体生长状态比较好，一般在30小时左右生物量达到最高，30小时到4