实验三植物不定芽诱导与快繁技术.ppt

1、第四章 器官培养 宜职院08.9,目的与要求 了解离体根培养的实践意义，掌握离体根的培养方法，熟悉离体根培养的培养基配方。了解植物茎尖培养的意义，掌握茎尖培养的方法，以及茎尖微繁技术。掌握叶培养概念，离体叶组织培养方法，了解影响叶片组织脱分化和再分化因素。 具有植物离体根培养的认知和进行根培养的基础能力，具有熟练进行植物茎尖培养和茎段培养的能力，具有叶培养认知和进行叶培养的基础能力。,一、根培养的实践意义 1、是进行根系生理代谢研究的最优良试验体系。 2、是研究器官分化、形态建成的良好体系。 3、建立快速生长的根无性系，对药物生产有重要意义。 4、对根细胞培养物进行诱变处理，可筛选突变体，用于

2、育种实践。,第一节 根的培养,二、离体根的培养方法 1、培养步骤： 离体根培养的第一步是要获得无性繁殖系。 方法如下： 种子表面消毒无菌条件下萌发根伸长后切取1.0cm长的根尖接种于培养基侧根生长切取侧根的根尖扩大培养获离体根无性系,胡萝卜根培养,2、一般方法 100ml三角瓶，内装40-50ml培养液，如长时间培养，可采用大型器皿500-1000ml培养液的发酵瓶进行培养。根据需要可在瓶中添加新鲜培养液继续培养或分割转移后继代培养。为避免培养过程中培养基成分变化对生长的影响，可采用流动培养方法。,2、根瘤菌结瘤实验的特殊方法 Raggio1965年等设计了离体根的结瘤实验装置。 此装置由两个

3、部分组成，下部是试管，管中装有含无机盐的营养液，并接种根瘤菌，上部是玻璃盖，盖中有一单向开口的管状凹槽，槽中盛放含有有机化合物的琼脂固体培养基。故有机营养从根基部吸收，无机营养从根尖吸收。,Bunting和Horrocks1964年修改了Raggio等的装置，变为在粗沙中提供无机盐。利用这一技术研究菜豆、大豆等离体根根瘤菌的固氮情况，结果表明这些根瘤菌含有血红蛋白，并能固定大气中的氮。,Raggio 装置,三、离体根培养所用的培养基 离体根培养多用无机离子浓度低的White培养基或其他培养基，MS、B5等也可采用，但必须将其浓度稀释到2/3或1/2。 苜蓿离体根的培养液和西红柿离体根的培养液如

4、下：,成份 苜蓿浓度(mg/L) 西红柿浓度(mg/L) Ca(NO3)2.4H2O 200 143.9 Na2SO4 200 100 KCl 65 40 KNO3 82 NaH2PO4.2H2O 18.6 10.6 MgSO4.7H2O 740 368.5 MnSO4.4H2O 4.5 3.35 FeC6H5O7.3H2O 4. 2.25 ZnSO4.7H2O 2.7 1.34 H3BO3 1.5 0.75 KI 0.8 0.38 CuSO4.5H2O 0.004 0.002 MoO3 0.02 0.01 甘氨酸 3 4 烟酸 0.5 0.75 维生素B1 0.1 0.1 维生素B6 0.1

5、 0.1 蔗糖 20000 15000 Ph 5.5 5.2,四、影响离体根生长的因素 1、基因型 不同植物的根对培养的反应不同，番茄、烟草、马铃薯、小麦可快速生长并继代培养无限生长。萝卜、豌豆需长时间且有限。木本植物很难生长。 2、营养条件 硝酸盐是最好氮源，蔗糖是最好碳源，铁、锰、硼、硫、维生素不能缺少。 3、激素 生长素对不同植物反应不同 4、pH 5、光照和温度 25-27,第二节 茎尖培养 一、概念和意义 1、茎尖培养概念 茎尖分生组织培养：指对不超过0.1mm的茎尖或几十微米的茎尖进行的培养。特点：可获无病毒苗，操作困难，成苗时间长。 普通茎尖培养：对几毫米至几十毫米长的茎尖、芽尖

6、及侧芽的培养。操作技术简单、易成活、成苗时间短、繁殖速度快。,2、茎尖培养意义 茎尖培养在园艺植物离体培养中最常见，可快速繁殖无性系、培养无病毒苗、品种改良。,二、茎尖培养一般方法 （一）材料的制备 健壮枝梢-去除叶片-分成1-2cm-自来水冲洗消毒-75%的酒精30秒-0.1%升汞或20倍次氯酸钠消毒8-10min-无菌水-修剪剥离茎尖，通常切割下顶端0.1-0.1叶原基的茎尖-（无菌水）-接种。 （二）培养基 多为MS培养基及其改良配方，还有White配方、B5配方、Heller配方、Gautheret配方等。,（三）培养方法 1、固体培养法 特点：琼脂做凝固剂，茎尖基部紧贴培养基。 优点

7、：操作较为简单，普遍。 缺点：对有些植物培养较难。 操作：培养基分装灭菌冷却茎尖接种25+3培养。 2、纸桥培养法 滤纸取代琼脂，液体培养基。 优点：营养物质能均衡持久地供给外植体，利于外植体健康生长。 缺点：操作复杂。,三、普通茎尖培养与繁殖技术 茎尖培养可进行植物的无性快繁，并且技术较为成熟，也叫微繁技术。 （一）茎尖微繁技术的一般方法 1、无菌培养体系的建立 外植体制备：正在生长的芽或腋芽、茎段、鳞茎切块、块茎、球茎。茎尖组织大小为带2-4个叶原基或更多。 操作程序：类似一般无菌操作基本技术培养基：MS、B5、White等，糖2-3%，生长调节剂。 培养条件：1000-3000Lx、16

8、h、25。,2、芽的增殖 顶芽和腋芽的发育；利用顶端优势 诱导不定芽产生；外植体直接产生不定芽 外植体脱分化-愈伤组织-不定芽 原球茎的发育； 原球茎种子发芽时，胚根部不出现，胚逐渐增大，种皮一端破裂，膨大的胚呈圆锥状，称为原球茎。即缩短的、珠粒状的、胚性细胞组成、类似于球茎的器官。 芽和种子发育原球茎植株,3、中间繁殖体的增殖 第二阶段产生的芽、苗和原球茎，统称为中间繁殖体。 茎尖的发育方向及调节是采用生长调节剂，BA、KT、2iP促进发芽，IBA、NAA、2，4-D促生根。 4、壮苗和生根 胚状体可直接成苗，腋芽和不定芽须转入生根培养基培养。矿质元素高利于茎叶生长，低利于生根，故生根培养基

9、中无机盐低。,难生根的植物可以采取： 降低无机盐浓度，1/2 MS培养基 采用IBA、NAA0.1-0.5mg/L 。 添加吸附剂。 减少琼脂。,5、试管苗的移植 小根5cm左右可以炼苗移栽。即将形成的小植株转移到土壤的过程。这个过程是微繁殖最关键的一步。 保持小苗水分供需平衡 选择适当的介质：珍珠岩、蛭石、粗砂、炉灰渣、锯木屑等。 防止杂菌滋生：保持环境干净，农药灭菌。 注意光温管理：避免阳光直射、温度适宜。,（二）影响茎尖微繁因素 1、基因型 2、外植体大小 3、供试植株生理状态 4、芽在植株上部位 5、供试植株年龄 6、培养基 7、褐变 8、玻璃化 9、极性 10、后生变化 11、中间繁

10、殖体的形态发生能力 12、遗传稳定性,茎段 茎尖取材有限，可采用带节或不带牙的茎段进行培养。,第三节 叶的培养 一、离体叶培养概念及意义 1、离体叶培养概念 指包括叶原基、叶柄、叶鞘、叶片、子叶等叶组织的无菌培养。多经脱分化形成愈伤组织，再由后者分化出茎和根。,2、离体叶培养意义 研究叶形态建成、光合作用、叶绿素形成等理论问题的良好方法。 通过叶片组织的脱分化和再分化培养，以证实叶细胞的全能性。 通过离体叶组织、细胞的培养，探索离体叶组织、细胞培养的条件和影响因素。 利用离体叶组织的再生特性，建立植物体细胞快速无性繁殖系，提高某些不易繁殖植物的繁殖系数。 叶细胞培养物是良好的遗传诱变系统，经过

11、自然变异或者人工诱变处理可筛选出突变体应用于育种实践。,二、叶培养方法 （一）叶原基培养：叶原基培养是研究形态建成的重要手段。 1、采用休眠期顶芽，剥去一部分鳞片。 2、在次氯酸5%溶液中浸泡20min，进行表面消毒。 3、切取柱状叶原基进行培养。 培养基采用Knops无机盐（部分修改）或Kundson（1951）配方，添加Nitsch配方中的微量元素（再加CoCL225mg/L）和2%蔗糖、8%琼脂，Ph5.5。部分实验中添加维生素、NAA、水解酪蛋白等，温度24，人工光照24h。,（二）叶片组织的脱分化与再分化培养 1、叶组织培养的一般方法 叶组织分离与消毒 大多数植物的叶原基、幼嫩叶片，

12、双子叶植物的子叶，单子叶植物心叶的叶尖组织，都可用于叶组织的脱分化与再分化培养。,方法一： 幼嫩叶片培养时：选取植株顶端未充分展开的幼嫩叶片流水冲洗蘸有少量75%酒精的纱布擦拭叶片两面放入0.1%升汞溶液中消毒5-8min无菌水冲洗3-4次消毒后叶片转入到铺有滤纸的无菌培养皿内解剖刀切成0.5cm0.5cm左右的小块或薄片（如叶柄和子叶）上表皮朝上接在固体培养基上培养。,方法二： 70%酒精漂洗约10秒，饱和漂白粉液中浸3-15分钟，无菌水冲洗数次，放在无菌的干滤纸上吸干水分以供接种用。对一些粗糙或带绒毛的叶片要延长灭菌时间。注意要选择成熟的叶片。 同一叶片的栅栏组织比海绵组织较成熟。培养叶肉

13、时因海绵组织在分裂前就死亡，如果栅栏组织不发达就难培养。,叶片愈伤组织诱导形成,培养基 常用MS、B5、White、N6等培养基，3%糖，培养基中添加椰子汁等有机添加物，有利于叶片组织培养中的形态发生。 大多数双子叶植物的叶组织培养，细胞分裂素特别是KT、6-BA有利于芽的形成，生长素特别是NAA有利于根的发生，2,4-D有利于遇伤组织的形成。一般BA 1-3mg/l，NAA 0.25-1mg/l。,培养 25-28，光照12-14h，光照度1500-2000Lx，不定芽分化和生长期间3000-10000Lx。 2、影响叶肉组织培养的因素 基因型 不同植物种类、同一物种的不同品种间在叶组织培养特性上有一定的差异。 细胞分裂素与生长素的组合 两种细胞分裂素都能促进芽的分化，6-BA的作用好于KT，但6-BA对不定芽的进一步发育（茎叶的形成）有抑制作用。,细胞分裂素与生长素的组合 细胞分裂素与生长素配合使用，诱导芽分化效果好于单独使用细胞分裂素。 供试植株的发育时间和叶龄 个体发育早期的幼嫩叶片较成熟幼嫩叶片分化能力高，发育完全的叶片组织器官分化能力较幼龄叶片组织再分化能力低得多。 叶脉 叶脉、叶柄分化能力较强。,极性 叶背面朝上放置就不生长。 损伤 损伤后刺激诱导愈伤组织生长和器官发生