《牙周病分子生物学》PPT课件.ppt

1、牙周病分子生物学molecular biology of periodontal diseases，李德chigh第二医学院附属第九人民医院，1，概述2，牙周病的分子致病性1。微生物的毒力因子2。宿主因子3、核酸杂交法牙周病相关细菌检测、定义、研究内容宿主基因水平或分子水平，揭示了牙周病的发病机制和规律牙周病原体的蛋白质和核酸(DNA、RNA)分子结构，追踪病原体传播途径，发现致病源变异。牙周病的发生发展规律与微观病原体或宿主基因特性有关，因此研究牙周病临床的分子诊断、分子征象、分子预后、基因治疗、牙周病的分子发病、微生物的毒性因子，评价牙周病原菌的蛋白质和核酸分子结构，从而评价毒力因子的作用

2、。宿主因子研究细胞因子和基因因子的作用。微生物的毒性因子微差异因子，内毒素G-菌胞壁外膜的脂多糖成分(磷脂多糖蛋白)。十二烷基磺酸钠聚丙烯凝胶传记电泳PAGE-SDS gel染色银杆菌内毒素免疫印迹LPS-immuno-blotting，牙龈素原胰蛋白酶样蛋白酶，精氨酸牙龈-精-精(Rgps):特异性阻断蛋白质和精氨酸残基的结合，用rgpA(前肽区、蛋白酶区、粘连区)和rgpB(无粘连区)两个基因编码赖氨酸牙龈素Kgp(全肽区，蛋白酶区，粘附区)单基因编码，Pg同源突变的性质改变突变。rgpA粘合力部分下降剂I型胶原能力丧失rgpA，RGPB抑制中性细胞功能丧失菌毛损失kgp群落不能变黑(影响

3、血红蛋白使用)rgpA，rgpB，rgpB毒性作用：破坏宿主组织细胞的活性成分(蛋白质，多肽)，分解胶原蛋白。促进慢激素释放，提高血管渗透性，增加牙龈沟液量，组织组织水肿。帮助细胞生长：将组织蛋白分解成短的肽链，扩大细菌营养摄取范围，为细菌生长和毒力提供营养。干扰宿主免疫反应：影响中性白细胞功能，分解宿主细胞的LPS受体CD14，细胞因子IL-1，IL-6，IL-8，TNF等。菌聚单位蛋白质结构基因(FIM A)粘附相关的毒性因子纤毛素粘附素(adhesin)血细胞凝集素(hemagglutinin)，1988年Dickinson等首先获得了编码Pg纤毛素基因的克隆，胶原酶基因(prtc) P

4、g的胶原蛋白分解I型胶原蛋白，破坏牙周组织附着。表示胶原酶活性的prtc基因序列存在于Pg的3个茄子主要血清素中，编码了1个37501.38蛋白质。白细胞毒素基因(lkt A、B、C、D) Aa是口腔中唯一能产生白细胞毒素(lkt)的细菌，白细胞毒素能抑制人或灵长类动物的多形核白细胞、单核细胞、巨噬细胞杀死宿主、破坏宿主的免疫防御机制。现在复制并测量lkt A的序列，在受体菌中表达。编码毒素结构，激活白细胞毒素。宿主因子Host Factors，细胞因子(cytokines)细胞生物学细胞因子cytokine(CK)免疫学淋巴因子lymphokine interleukincytikine(L

5、i)血液学集合刺激因子colony stine在体内发挥广泛的生物学作用与生长、分化、免疫、肿瘤、造血、创伤愈合等多种生理病理状态有关。正常情况下发挥广泛的生理功能，一旦不平衡异常分泌，就与疾病有关。目前发现的细胞因子为10多个族，每个族有几个亚族，共有100多个种，功能大部分已经部分复制成功，其基因图谱、结构、受体结合机制等都在进行大量研究。白细胞介素(1-18型糖蛋白)(IL)肿瘤坏死因子(TNF)黏附分子(AM) IFN)转化生长因子-(transsion整体性细胞，对组织的调节不是一种，而是多因子参与和多层次反应，多茄子因子协同或拮抗，形成网络(network)。(威廉莎士比亚，Nor

6、thern Exposure(美国电视电视剧)，organization(组织)，genetic factors(基因)基因水平阐明了牙周病的发生、发展和流行规律。细菌是引起牙周炎必不可少的渡边杏因素，但不是唯一的因素，宿主也起着重要作用。单纯遗传可以为患严重牙周炎提供50%以上的风险。例如白细胞减少症白细胞粘附缺陷病Down综合征跖角化牙周破坏综合征、牙周病的基因研究6号染色体组织相容性点变异降低了IgG2能力，IgG2具有保护性。调节细菌，容易吞咽。染色体1q H131残基多重性组酸纯合物具有细胞识别IgG2的hFcrRa受体亲和力高(IgG囊泡的致病菌容易吞噬)。精氨酸纯合受体亲和力较低

7、的组/精氨酸杂合亲和力的中心，染色体2q 13的IL-1基因多态性生成的IL-1约是牙齿基因中女性的4倍。40岁后患严重牙周炎的可能性是女性个体的20倍6号染色体TNF-基因多态性产生大量TNF，提高对感染的反应性，检测核酸杂交(molecular hybridization)牙齿牙周病相关细菌的可能性。细菌分类学4级细菌形态和行为水平：显微结构、运动性、酶、生化、营养要求等细菌分组水平：细胞壁、脂肪、细胞色素、噬菌体分析蛋白水平：氨基酸系列、水溶性蛋白质凝胶电泳游泳、血清学基因水平：GC mol%，DNA与牙周病相关的特殊细菌证据充分的病原体中间证据病菌，伴有放线菌Aa直肠弯曲杆菌(camp

8、ylobacter rectus)牙龈单胞杆菌Pg蒺藜菌(Porphyromonas)。eub acterium nodatum Fusobacterium Bf球核梭杆菌分支杆菌(fn)(fusobacteruim nucleatum)中间prevotella interments pi大部分厌氧菌培养条件要求高感情烦杂。每个牙龈口袋至少要提取2个区域样本，每个样本至少要分离10株以上可疑细菌。原理所有生物都以DNA格式通过4茄子碱基序列存储遗传信息。相同的生物含有相同的DNA序列。生物种类的差异越大，DNA碱基序列的差异就越大。鸟氨酸嘧啶G A C T C T示踪分子标记的特定碱基序列的核

9、酸片段可以与互补碱基配对，特异性结合。，4茄子核苷酸构成DNA 2个互补链围绕双螺旋结构(氢键)严格配对的规律牢固结合，DNA与遗传信息存储功能(定性、特异性)DNA相邻的3个核苷酸1个密码子，根据特定氨基酸DNA核苷酸顺序决定蛋白的氨基酸顺序，细胞结构和功能，核酸探针使用已知细菌的DNA探针检测未知细菌的DNA，如果能杂交DNA双链，就把该菌视为探针等菌。放射性同位素标记：例如，32P，35S，3H灵敏度高的化学化影响使用小污染环境部分抗原：生物素，地高辛，荧光素特异性低敏感性低，合成小单链DNA方法日益完善，寡核苷酸的化学合成可以用高度自动化的仪器完成核酸交配技术。探针类型全基因探针：内代

10、表菌分离DNA。特异性不好，有时能与类似的物种杂交，复制DNA片段探针。用代表细菌DNA的限制性内切酶随意复制部分片段，与本属菌株交配的DNA片段特异性很高，但需要大量的实验才能验证其特异性特定探针。克隆中表示细菌特异性蛋白或毒力因子的基因，但特异性、敏感性验证、探针的验证特异性验证：必须与50种杆菌属80300株菌株杂交，排除同类细菌中的大量细菌和“交叉杂交”，oligonucleotide探针序列细菌探针名称序列特定DNA片段探针序列(基因探针)细菌目标基因序列长度aalkta 5-cagcagctgcagtgcaaa-3238 BP 5-cattagtatgcgcctct-3 16sr DNA 5-GC tatact cttact，16SrRNA基因：与细菌染色体编码的rRNA相对应的DNA序列保守区稳定性(细菌孔刘，“分子化石”)作用域特异性16 SRNA编码基因保守区的引物：适合所有细菌的引物可变区引物：PCR扩增，凝胶传记神童在细菌物种间隔区的引物：16SrRNA和23SrRNA在标本中可以直接识别