Sf9细胞的培养及转染.ppt

1、Sf-9细胞、Sf-9细胞、Sf-9细胞的培养和转染是由史密斯和切里于1983年从细胞系IPLB获得的克隆。IPLB-SF 21 AE是沃恩等人于1977年从甜菜夜蛾蛹的卵巢组织中获得的。Sf-9是一种半贴壁细胞，但其贴壁能力不强，但单层培养也可悬浮培养。Sf-9细胞的形态学，培养细胞的生长条件，1。细胞的营养需求。细胞生存环境温度：28氧，ph，pH:渗透压7.2-7.4，3。无污染，4。无毒，实验材料：实验用品：洁净工作台，压力蒸汽灭菌器，电动干燥箱，过滤器，酸罐生化培养箱倒置显微镜酶标仪，酶标仪摇床液氮罐自动双纯水蒸馏器，纯水仪器耗材：培养瓶，吸管，电动吸引器，培养板，冷冻管，超净工作台

2、，洁净工作台的工作原理是用鼓风机带动空气逸出，通过高效过滤器去除空气中的尘粒，使空气得到净化。净化后的空气缓慢通过工作台表面，从而在工作台上形成无菌环境。生化培养箱，生化培养箱设置条件为28。使用生化培养箱培养细胞时应注意的问题：1)保持培养箱内空气清洁。定期消毒(90，14小时)。2)在3000毫升蒸馏水箱中对蒸馏水进行消毒，以保持水箱中的湿度，避免培养液蒸发。培养瓶，将培养瓶保持在正确的位置：用拇指和食指握住培养瓶，瓶口向外，中指托住瓶底。保持瓶子水平，防止培养液落入瓶口。血细胞计数板，细胞冷冻和复苏的原理：缓慢冷冻和快速解冻当细胞冷却到零度以下时，会发生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性

3、物质浓度增加，细胞中形成冰晶。如果冷冻缓慢，细胞会逐渐脱水，细胞内不会产生大的冰晶；相反，晶体很大，会导致细胞膜和细胞器的损伤和破裂。回收过程应迅速融化，以防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的再结晶。慢速冷冻程序，标准程序：当温度高于-25，12 /min时，当温度低于-25，510 /min时，当温度达到-100时，可迅速放入液氮中进行细胞冷冻保存。简单步骤：将冷冻管(管口朝上)放入纱布袋中，用细绳绑住，用细绳将纱布袋固定在液氮罐口(1)从液氮中取出冷冻管，迅速放入3738水浴中融化(约1分钟)。(2)在5分钟内用培养液稀释至原体积的10倍以上。(3)低速离心10分钟。(4)去除上清液，加入新鲜培

4、养液培养新回收的细胞。对于Sf9细胞的传代，判断分离的(分散的)细胞培养物是否需要传代的主要指标是观察培养物是否基本上覆盖了培养瓶的底壁。一般来说，原代培养达不到生长基质表面积的80%，所以不要急于传代培养，尤其是首次传代培养。Sf9的分裂周期约为27小时。Sf9的传代方法包括：1)吸收或倒出旧培养基。2)加入一定量的新培养基，用吸管吸取培养液，反复吹瓶底壁，使半贴壁细胞从瓶底壁分离。吹气过程必须以有序的方式进行，即从一侧到另一侧，特别是在容器的边缘和四个角，以确保烧瓶底壁上的所有细胞都被吹走。吹气时，动作不要太用力，吹出液体的力度要适中，否则会直接损伤细胞，产生气泡，损伤细胞。或者增加细胞碎

5、片。吹气后，获得细胞悬浮液。Sf9继代培养法，3)接种在新培养瓶中。一般来说，它是接种在两个或更多的培养瓶。有时，亚文化只是为了让文化经历和适应亚文化过程。当培养物中的细胞数量少时，只在培养物f中接种4)送入培养箱继续培养。对于像Sf9这样的半附着培养物，可以采取以下步骤：吸取或倒出(部分或全部)旧培养液。加入新鲜培养液。添加量与换液前相同。把它放回原来的培养箱继续培养。转染是指真核细胞由于掺入外源基因而获得新的遗传标记的过程。化学包括：DEAE-葡聚糖法、磷酸钙法、人工脂质体法，物理包括：显微注射电穿孔基因枪*杆状体、BAC-BAC表达系统、杆状病毒表达载体系统(bevs)，连同细菌、酵母和

6、哺乳动物细胞，被公认为当今世界基因工程的四大表达系统。的特性，可以对高表达的蛋白质进行更完善的翻译后处理，如糖基化、磷酸化、酰化、信号肽切除等；与其他真核和细胞表达系统相比，重组蛋白可以高水平表达，高达细胞总蛋白的50%；它对脊椎动物没有传染性，并且已经证明它们的启动子在大多数哺乳动物细胞中也是无活性的，因此它比其它表达系统更有利于表达一些致癌物和潜在的毒性蛋白质；能容纳大分子片段的插入和表达；它可以在一个细胞和载体中同时表达多个外源基因。它可以确保细胞中高度表达的外源蛋白的正确折叠和二硫键匹配。杆状病毒目前已知全基因组序列的杆状病毒只有7种，即：苜蓿口疮核多角体病毒、家蚕核多角体病毒、杉木多

7、核多角体病毒、舞毒蛾多核多角体病毒和甜菜夜蛾多核多角体病毒、棉铃虫核多角体病毒它是不溶性蛋白质和核糖核酸的密集集合体，包含大多数表达的蛋白质。)，在感染后期可在细胞中累积高达30%和50%，是病毒复制的不必要成分，但它对病毒颗粒具有保护作用，可保持它们的稳定性和传染性。Bacmid，一种能快速高效生产的重组AcMNPV病毒。杆状病毒和质粒的英文前缀和后缀被命名为Bacmid，意思是杆状病毒质粒。该载体可在大肠杆菌样质粒中生长，对鳞翅目昆虫细胞具有传染性。昆虫杆状病毒表达系统的组成，表达过程：1 .将外源目的基因插入启动子下游，与杆状病毒重组，获得重组病毒(酶消化和连续转化)。纯化重组病毒3。感染昆虫细胞或昆虫体(转染)4。外源基因随着病毒的复制而表达*人细小病毒B19-XA株VP1蛋白在Bac-to-Bac系统中的表达和反应性* Bac-Tobac杆状病毒表达系统的实验流程，转染基本步骤：1