体内药物分析常用生物样品处理方法和方法学验证

1、体内药物分析的样品处理和方法验证，1。为什么要处理生物样本？2.有什么生物样本？3.样品处理方法是什么？他们各自的特点。4.如何验证分析方法？5.参考标准是什么？2.生物样品预处理的目的如下：1 .药物进入人体后，被吸收、分配和代谢，然后排出体外。在体液、组织和排泄物中，不仅有游离(原型)药物，还有药物代谢物、药物-蛋白质缀合物、药物或其代谢物和内源性物质，如葡萄糖醛酸、硫酸形成的葡萄糖醛酸苷、硫酸酯缀合物等。这需要在分离后确定。三一。治疗的目的，2 .生物样品的培养基成分很复杂。例如，血清不仅含有高分子蛋白质和低分子有机化合物如糖、脂肪和尿素，还含有无机化合物如钠、钾和氯。这些成分会严重影响

2、测定的准确度和灵敏度，同时污染仪器。因此，为了保护仪器，提高灵敏度，保证测试结果的准确性和可靠性，必须对样品进行预处理。超过4%、5%和60%的能源和费用用于样品预处理。生物样本包括各种体液和组织，但事实上，最常用的是血液(全血、血浆和血清)、尿液、粪便和唾液。在某些特殊情况下，选择牛奶和脑脊液。6、2、生物样品的种类，全血不易保存，而且血细胞含有较多的干扰物质，影响测定，因此全血很少用于测定药物浓度。仅适用于血浆药物浓度过低或波动较大且难以控制的药物，如环孢素A。血液中药物浓度的测定通常是指血浆或血清中药物浓度的测定，而不是含血细胞的全血中药物浓度的测定。将收集的血液放入含有抗凝剂(如肝素和

3、乙二胺四乙酸)的试管中，混合，以3000-4000转/分钟的速度离心，分离血细胞。上清液是血浆。8，2血浆，9，血浆中所含物质的类型和比例，收集不含任何抗凝血剂的血清，然后在室温下放置15-30分钟，然后离心分离上清液。与血浆相比，血清颜色较浅，纤维蛋白含量较少，因此更容易处理，血浆和血清中药物浓度的测定值通常是相同的。10，3血清，一般认为当药物在体内达到稳定状态时，血浆中的药物浓度与作用部位的药物浓度密切相关，即血浆中的药物浓度反映了药物在体内(靶器官)的状态，因此血浆浓度可以作为作用部位药物浓度的可靠指标。血浆和血清可在冷冻条件下稳定保存，一般在-20，也可在-80下长期保存，是生物样品

4、检测中最常用的样品。尿液的主要成分是水、尿素和无机盐。收集尿样后，通常添加防腐剂进行保存。体内药物清除主要通过尿液排出，药物可以原型、代谢物及其结合物的形式排出。尿液中的药物浓度很高，但尿液浓度受尿量的影响，尿量通常变化很大。排入尿液的药物总量应在一定时间内确定。尿液和唾液中所含成分相对简单易得，但唾液浓度与血浆游离药物浓度之间只有少数药物存在相关性，在实践中很少使用。当药物血浆结合率高时，唾液中的药物浓度极低且难以检测。13，5唾液，除取样后立即分析外，为了防止药物变化，应：短期保存，但4冷藏；长期保存，可在-20冷冻，不要反复冻融，必要时添加酶抑制剂和抗氧化剂。14，生物样品的保存：应考虑

5、生物样品的类型、受试药物的性质和测定方法。15，3。常见的治疗方法：1 .蛋白质PPT 2的沉淀。液-液萃取LLE 3。固相萃取固相萃取16，1。蛋白质沉淀，通过有机溶剂沉淀法加入水溶性有机溶剂，可以提高蛋白质的稳定性常用的有机溶剂有乙腈、甲醇、乙醇、丙醇、丙酮、四氢呋喃等。当血浆或血清与有机溶剂的体积比为1:3时，可去除90%以上的蛋白质，低温高速离心10分钟，以16000转/分钟的速度可使沉淀的蛋白质完全沉淀。在实际应用中，取血浆50uL，加入有机溶剂500uL，离心后取上清液注射；如果沉淀后信号不好，试着改变有机溶剂或在沉淀过程中加入酸或碱来调节酸碱度，这可能对结果有很大影响；常用的酸和

6、碱有：盐酸、甲酸、乙酸、氨水等。17，优点：易于操作，是方法开发中首先要考虑的。缺点：仅用于样品中高浓度药物的测定；处理后，样品中仍有许多干扰物质，会干扰结果。残留的杂质会堵塞色谱柱，污染仪器。18，中性盐可以用蛋白质代替水，使蛋白质脱水和沉淀。常用中性盐：饱和硫酸铵、硫酸钠、镁盐、磷酸盐和柠檬酸盐等。盐析法和有机溶剂萃取法常用，药物回收率较高。加入中性盐、19、20、20和强酸。当酸碱度低于蛋白质的等电点时，蛋白质以阳离子形式存在。加入强酸会与蛋白质阳离子形成不溶性盐并沉淀。常用的强酸有：10%三氯乙酸等。血清与强酸的比例为1:0.6，可通过高速离心去除蛋白质。在酸性条件下分解的药物不能用这

7、种方法去蛋白。当酸碱度高于蛋白质的等电点时，金属阳离子与蛋白质分子中带负电荷的羧基形成不溶性盐并沉淀。常用的沉淀剂有硫酸铜、硫化锌、氢氧化钠等。含药血清与沉淀剂的比例为1:2，经高速离心分离后得到上清液。21，加入锌盐或铜盐沉淀剂，在测定某些具有不稳定酸和强蛋白质结合的药物时经常需要酶解。当测定尿液中的药物浓度时，由于尿液中的药物主要以结合物的形式被排除，它们比原型药物更具极性，并且不容易被有机溶剂提取。酶水解是常用的。22、酶解、超速离心平衡透析主要用于测定血浆中游离药物的浓度和药物的血浆蛋白结合率。其他一些去除蛋白质的方法：药物在体内被吸收，需要通过细胞膜转运，因此大多数药物具有一定的脂溶

8、性，而生物样品中的大多数内源性杂质都是强极性的水溶性物质，因此根据药物分子和基质的极性差异，可以用合适的有机溶剂提取药物，这样可以一次去除大部分杂质。24，2。对于采用液-液萃取法的LLE，有机溶剂应稳定、易挥发、毒性低且与水相不混溶。常用的有机溶剂有：乙醚、乙酸乙酯、正己烷、叔丁基甲基醚和氯仿。当应用该方法时，有必要考虑所选有机溶剂的特性、药物的特性、有机溶剂相与水相的体积比以及水相的酸碱度。酸性药物解离：AH H2O A- H碱性药物解离：B H2O B-OH药物的解离常数pKa是药物解离50%时溶液的酸碱度。25，药物的提取程度主要取决于水相的酸碱度。对于碱性药物，最好的酸碱度是比PKA

9、高1-2个单位；对于酸性药物，它比pKa值低1-2个单位；这样，90%的药物可以以非电离的形式存在，这使得它们在有机溶剂中更易溶解。常用于调节酸碱度的物质有甲酸、乙酸、盐酸或氨水、氢氧化钠等。水相的酸碱度影响液-液萃取的最关键因素，26。有两种特定的提取模式，直接提取和反向提取。优点：样品提取后，可以去除大部分杂质，相对“干净”；可以通过蒸发和再溶解有机溶剂来浓缩样品。大多数药物都是脂溶性的，并且具有广泛的缺点：费时费力，操作复杂；当提取血浆时，血浆中的脂质将被一起提取。使用质谱检测器时，离子源处会产生基体效应，严重干扰质谱检测结果的准确性！27、在方法探索中，一般是使用上述溶剂，并行操作，同

10、时提取，加入空白对照，比较结果，判断哪种有机溶剂具有最佳提取效果；如果都不理想，可以将上述溶剂混合后再次使用，可以调整1:1、1:2和1:3的使用比例；在探索合适的提取溶剂时，可以根据药物的酸碱性，尝试加入一些酸、碱或离子对试剂，以提高回收率；在提取过程中，必须严格控制酸碱度。对于两性药物，应使用缓冲溶液，以确保稳定和可重复的提取回收率。例如，28、29:取100微升血浆样品、20微升同位素内标、50微升甲酸、1微升正己烷和3微升叔丁基甲基醚，涡旋10分钟，以3000转/分钟离心10分钟，在-80冷冻10分钟，倒出上层有机层，在40水浴中用氮气吹干，在150微升中用丙酮溶解，在50微升中用丹磺

11、酰氯的丙酮溶液溶解。在40水浴中孵育20分钟，磷酸盐缓冲液2mL叔丁基甲基醚4mL，涡旋振荡10分钟，以3000转/分钟离心10分钟，在-80冷冻10分钟，倒出上层有机层，在40水浴中用氮气干燥，再溶解流动相。固相萃取是20世纪80年代中期发展起来的样品预处理技术。由液-固萃取和液相色谱结合而成。样品的分离、纯化和富集主要是通过固相填料对样品组分的选择性吸附和解吸过程实现的。主要目的是减少样品基体干扰，提高检测灵敏度。固相萃取固相萃取的基本原理和方法：固相萃取技术是基于液固色谱理论，利用选择性吸附和选择性洗脱来富集、分离和纯化样品。它是一个包括液相和固相的物理萃取过程；它也可以被视为一个简单的

12、色谱过程。常用的方法是将液体样品通过吸附剂，保留其中的被测物质，然后选择合适浓度的溶剂洗去杂质，再用少量的好溶剂洗脱被测物质，从而达到快速分离、纯化和浓缩的目的。它还可以选择性地吸附干扰杂质，让被测物质流出。31，32，33，萃取柱可使用一次以防止交叉污染！固相萃取通常有五个步骤：活化甲醇/乙腈以润湿柱和活化填料；用平衡水或适当的缓冲溶液冲洗平衡柱；将样品转移至色谱柱，并泵出废液；用水或缓冲溶液冲洗，以最大程度地消除干扰；洗脱：用少量溶剂洗脱被测物质并收集。34，1。正相色谱原理2。反相色谱原理3。离子交换原理。根据原则分类：36，37。固相萃取法的优点：1 .不乳化；2.应用范围广；3.提取

13、效率高；4.方便快捷，可一次提取分离多种化合物；5.溶剂消耗更少；6.易于实现自动化；7.离子交换固相萃取利用离子交换原理，这与色谱柱按极性分离的原理不同。当一起使用时，它可以最大限度地分离药物和消除干扰。目前，商业化的固相萃取柱已被广泛使用。三种方法的比较：药物化学衍生化的目的是使药物具有可分离性；提高检测的灵敏度；增强药物的稳定性；提高分离旋光异构体的能力。所有分子中含有活性氢的药物都可以进行化学衍生，例如，含有官能团如-COOH、-OH、-NH2、-NH-、-SH的药物都可以进行衍生。39，4。高效液相色谱中的化学衍生，包括柱前衍生和柱后衍生。在柱前衍生化分析之前，应尽可能地提取和分离药

14、物，然后衍生化以防止其他杂质，40，41，定量下限为10 pg！分析和确定待测药物的物理和化学性质及其在生物体中的存在的目的和要求。生物样品的类型和预处理方法。实验室条件。42.体内药物分析方法的建立。1.光谱分析。2.色谱。毛细管电泳。4.免疫测定。5.同位素方法。43.体内药物分析方法大致可分为以下几类：44。建立体内药物高效液相色谱-质谱/质谱分析方法的一般过程：2.使用标准产品，扫描质谱条件；3.选择色谱柱和流动相，探索合适的液相条件；4.根据样品矩阵，制备模拟生物样品，选择相应的样品处理方法，并对处理后的样品进行分析；5.调整样品处理方法或液相条件，进一步优化质谱参数；6.根据检测目

15、的，设定定量范围，研究方法。方法学验证，生物样品测定的关键是方法学的确认。方法学确认是整个药代动力学研究的基础。这是药代动力学研究的特点，不同于其他药理学和毒理学研究。所有药代动力学研究结果都依赖于生物样品的测定，只有可靠的方法才能得到可靠的结果，因此必须对已建立的方法进行验证。此外，应在实际样品检测过程中进行方法学质量控制，并应制备相应的标准曲线和测量质量控制样品，以确保检测方法的可靠性。45，46，47，生物分析方法验证指南-EMEA，48，49，50，4。校准曲线，结果要求校准曲线应至少包括六个浓度点、一个矩阵空白和一个控制零点(仅供参考，不包括在校准曲线的计算中)，必要时可进行双重测量

16、；每个浓度点的准确度应在85%-115%之间，精密度应小于15%，定量下限应在80%-120%和20%之间；不符合要求的浓度点可以不计算，但至少有75%的浓度点符合要求；在方法验证期间，应提供至少三条合格的标准曲线，以纳入统计数据。51，52，质量控制样品，QC，通过在生物基质中添加标准物质制备的模拟生物样品，可用作方法验证中的调查样品和样品测定中的方法质量控制。低浓度质控品(低质控品)浓度不应超过LOLQ的3倍。中等质量浓度通常是定量范围内的中等浓度。高质量控制(高质量控制)的浓度应至少为ULOQ的75%。质量控制样品建议由独立人员一次性制备。在样品被注射和分析后，它们被分成包装并冷冻保存。每次取足够数量的样品使用，其余的丢弃。53，54，55，8。稳定性稳定性，8.1分析物的标准储备液和工作液的稳定性，以及内标物8.2样品冷冻/解冻的第三溶液的稳定性，冷冻/解冻的短期稳定性，解冻后的8.3样品，解冻后的长期稳定性，8.4样品冷冻的长期稳定性，8.5样品中处理过的样品溶液的长期稳定