STR分型技术原理.ppt

1、DNA分型技术原理、基点认知技术(北京)有限公司，一、DNA分型的理论背景、DNA指纹或DNA分型是英国遗传学家Alec Jeffreys在1985年首次提出的。 Jeffreys博士，STR的含义，短序列重复序列(STR )是由26bp重复单位组成的核心序列，是广泛分布于人基因组的DNA片段，主要由核心序列拷贝数的变化产生长度多态性。 STR是重复单位长度为26的核苷酸的重复DNA序列，dinucleotide (ca ) (ca ) (ca ) tri nucleotide (gcc ) (gcc ) tetra nucleotide (aatg (AGT ACA )、STR是HGP带来了

2、更多的STR认知，现在已确定的4核苷酸的重复超过20，000个的全部基因组中的STR数可能超过100万！ STR占人类基因组序列整体的3，STR的特征：1.片段短，可复合扩增，提高识别能力。 2、多态性高，等位基因多，鉴别能力强。 3 .适用于旧样品，检验能力强。 4 .灵敏度高，有利于微量样品的检验。 5、检测手段自动化、标准化方便，重现性好。DNA分型步骤、二、DNA提取、聚合酶链反应(PCR )技术测定临床标本中的病原体核酸成分，是高度敏感、最直接的检测手段。 临床标本中含有蛋白质脂质等物质，为了干扰PCR反应，在进行PCR反应之前必须进行核酸提取。 临床上常见的标本有血清(纸浆)、全血

3、、分泌物、棉拭子、脓液、体液、新鲜组织、残奥翅片切片等，这些临床标本的处理和保存方法各不相同。 DNA提取方法、Chelex方法、Chelex是以亚氨基二乙酸为吸附因子的苯乙烯和二乙苯的共聚物，对多价金属离子有螯合作用，防止DNA在煮沸加热前分解，同时在高温低离子强度下催化DNA释放。 这样能够去除放大器中的一些抑制因素同时减少DNA的损失。 苯酚/氯仿法，原理：用苯酚-氯仿混合物提取DNA溶液中的蛋白质系有机物质，在水相溶液中残留DNA。 优点：应用所有生物检测材料，提取DNA分子结构完整，特别需要RFLP、测序等大分子DNA分析技术。 磁珠法是用磁性硅胶吸附白细胞，用细胞分裂液分解细胞，从

4、细胞游离的DNA分子被吸附在磁性粒子表面，蛋白质等分子没有被吸附而残留在溶液中。 磁场作用下磁性粒子从液体中分离，回收粒子，吸附的DNA用纯水或TE洗脱。 FTA卡、FTA技术的核心是专利化合物，FTA卡预先渗透到该化合物中，血液与FTA卡接触时细胞膜分裂，蛋白质变性，DNA分子被捕获并与载体牢固结合，并且FTA卡上的DNA在室温下长时间稳定保存，FTA卡在其上的硅胶膜法、硅胶膜需要在高盐缓冲液中有效吸附核酸。 在如高盐(例如35 mol/L盐酸胍)那样低ph(5.06.5)的状态下，硅胶膜特异性地吸附DNA。 另一方面，在低盐(TE或2.5 mmol/L Tris-HCL )或水溶液的状态下

5、，会释放出DNA。 理想的DNA样品要求，1 .纯度高：尽可能不污染RNA、蛋白质、多糖、脂质。 2 .完整性好： DNA片段较大，无分解。 3. DNA浓度适当：大多数商业STR分型试剂盒的最佳DNA浓度为1 ng左右。 三、PCR (聚合酶链反应)、PCR技术是体外模拟自然DNA复制过程的核酸扩增技术，又称无细胞分子克隆技术。 以扩增的两条DNA链为模板，通过一对人工合成的寡核苷酸引物，利用耐高温DNA聚合酶的酶促作用，快速、特异地扩增特定的DNA片段。1983年，Mullis发明了PCR技术、PCR的基本原理、13步骤重复2530轮，目标DNA片段放大100万倍以上，DNA双螺旋、DNA

6、单链和引物的恢复性、DNA复合放大的优点：在一次反应中获得更多的信息量减少工作量，提高效率模板需求量低，在同一反应体系中加入2对以上的引物，同时进行扩增而得到的，荧光标记的分析方法，荧光法：也被称为荧光PCR技术(fluoresencePCR，F-PCR )的荧光法是PCR的灵敏度， 融合DNA杂交的特异性和光谱技术的精确定量优点，直接检测计算机同步跟踪、数据自动化处理、PCR过程的变化得到定量结果，无需进行PCR后处理和检测，完全封闭操作。 荧光标记方法的示意图、毛细管电泳图像、常见的PCR放大器、ABI公司： 9700、9600、2400 Eppendorf公司： 5331、5332、53

7、33 Bio-Rad公司： myccd有很多PCR增强剂，原理各不相同根据其作用和原理，大致分为1 .用于增大GC含量或形成复杂二次结构的模板(共溶剂)(甜菜碱、二甲基亚甲基枫树(DMSO )、甲酰胺(formamide )、甘油)2.用于保护DNA的聚合酶0.1-10的明胶)3.为了优化引物与模板的结合(10-20mM的硫酸铵，四甲胺)4.其他增强剂(以pee Sanger酶法为原理，使用耐热DNA聚合酶参照待测模板系列在这个过程中用4种不同的荧光染料标记反应生成物，用毛细管电泳分离反应生成物，用固定的激光光源激发荧光信号，用CCD检查收集数据，用计算机分析处理得到序列信息，全过程高度自动化

8、。 四、毛细管电泳、毛细管电泳的原理、一束激光分成两束，从毛细管两侧同时照射16根毛细管，DNA片段通过检验室后，所有荧光染料被激发，荧光被检测，形成橡胶图案。检测、ABI 310的检测途径图、常用的毛细管电泳仪、五、DNA分型、电泳检测荧光色不同的DNA片段的峰长度，对应不同的颜色。 DNA片段与内标相比确定长度。 最后与同样确定的等位基因Ladder进行比较，得到未知样品的PCR产物碎片分类。 STR等位基因分类过程、数据收集、确定峰、标记峰、与Ladder的对比、Genotype读取等位基因、色分离、分析人员阅读数据、确定结果用PCR法放大得到的STR片段电泳检测放大产物的长度， 并与allelic ladder相