第八章 核酸的酶促降解和幻灯片.ppt

1、第八章 核酸的酶促降解和核苷酸代谢 （2学时）,1教学基本要求：要求学生掌握核苷酸的生物合成和酶促降解过程。 2教学内容： 第一节 核酸的酶促降解 一 核酸酶 二 脱氧核糖核酸酶 第二节 核苷酸的生物降解 一 核苷酸的降解 二 嘌呤的降解 三 嘧啶的降解 第三节 核苷酸的生物合成 一 核糖核苷酸的合成 二 脱氧核苷酸的合成 3主要知识点、重点与难点 主要知识点：核苷酸的生物合成，核苷酸的生物降解。 重点与难点：核苷酸的生物合成，核苷酸的酶促降解。,核酸,核苷酸,磷酸（P）,核苷,戊糖（R）,碱基（B）,复习：,核 糖 脱氧核糖,2,O,OH,H,HOCH,H,OH,H,1,2,3,4,5,H,

2、H,戊糖：,嘌呤：,嘧啶：,腺嘌呤（A）,鸟嘌呤（ G）,胞嘧啶（C）,尿嘧啶（U）,胸腺嘧啶（T）,核苷酸：,磷酸脱氧胞苷（dCMP）,由磷酸、戊糖和碱基三种成分构成的化合物,核苷酸的生物功能 合成核酸 是多种生物合成的活性中间物 糖原合成，UDP-G 磷脂合成，CDP-乙醇胺，CDP-二脂酰甘油。 生物能量的载体ATP、GTP 腺苷酸是三种重要辅酶的组分 NAD、FAD、CoA 信号分子cAMP、cGMP,第一节核酸的酶促降解 食物中的核酸，经肠道酶系降解成各种核苷酸，再在相关酶作用下，分解产生嘌呤、嘧啶、核糖、脱氧核糖和磷酸，然后被吸收。 吸收到体内的嘌呤和嘧啶，大部分被分解，少部分可再

3、利用，合成核苷酸。 人和动物所需的核酸无须直接依赖于食物，只要食物中有足够的磷酸盐、糖和蛋白质，核酸就能在体内正常合成。,核酸的消化与吸收,概 述,核酸是核苷酸以3、5-磷酸二酯键连成的高聚物，核酸分解代谢的第一步就是分解为核苷酸，作用于磷酸二酯键的酶称核酸酶（实质是磷酸二脂酶）。 根据对底物的专一性可分为： 核糖核酸酶、脱氧核糖核酸酶、非特异性核酸酶。 根据酶的作用方式分：内切酶、外切酶。,一、核酸酶 1、核糖核酸酶 只水解RNA磷酸二酯键的酶（RNase），不同的RNase专一性不同。 例：牛胰核糖核酸酶（RNaseI），作用位点是嘧啶核苷-3-磷酸与其它核苷酸间的连接键。 核糖核酸酶T1

4、（RNaseT1），作用位点是3 -鸟苷酸与其它核苷酸的5-OH间的键。,内切核酸酶对RNA的水解位点示意图,RNAase I,RNAase I,RNAase T1,RNAase T1,Pu ：嘌呤 Py：嘧啶,2、非特异性核酸酶 既可水解RNA，又可水解DNA磷酸二酯键的核酸酶。 例： 小球菌核酸酶是内切酶，可作用于RNA或变性的DNA，产生3-核苷酸或寡核苷酸。 蛇毒磷酸二酯酶和牛脾磷酸二脂酶属于外切酶。 蛇毒磷酸二酯酶能从RNA或DNA链的游离的3-OH逐个水解，生成5-核苷酸。 牛脾磷酸二酯酶从游离的5-OH开始逐个水解，生成3核苷酸。,外切核酸酶对核酸的水解位点,5,OH,B,3,B

5、,B,B,B,B,B,B,牛脾磷酸二酯酶（ 5端外切5得3）,蛇毒磷酸二酯酶（ 3端外切3得5）,二、脱氧核糖核酸酶 1、脱氧核糖核酸酶DNase 只能水解DNA磷酸二酯键的酶。 例：牛胰脱氧核糖核酸酶（DNaseI）可切割双链和单链DNA，产物是以5-磷酸为末端的寡核苷酸。 牛脾脱氧核糖核酸酶（DNaseII），降解产物为3-磷酸为末端的寡核苷酸。,2、限制性核酸内切酶： 发现： 1952， Smith Human 用T4 phage 感染E.coli. 提出了限制与修饰现象。 细菌体内能识别并水解外源双源DNA的核酸内切酶，产生3-OH和5-P。 有序列专一性，无碱基专一性 例： EcoR

6、切割后，形成5-P单链粘性末端。,限制性核酸内切酶的生物学功能：,（1）识别双链DNA上的特定位点即“回文结构”（长度在48个碱基对范围内，从前往后读和从后往前读完全一样的碱基序列），切割后错开的切口会产生互补的单链末端（粘性末端、平末端）。 （2）降解外面侵入的DNA，但不降解自身细胞的DNA，因为自身DNA的酶切位点上经甲基化修饰而得到保护。,常用的DNA限制性内切酶的专一性,酶,辨认的序列和切口,说明, A G C T T C G A , G G A T C C C C T A G G , A G A T C T T C T A G A , G A A T T C C T T A A G

7、 , A A G C T T T T C G A A , G T C G A C C A G C T G , C C C G G G G G G C C C ,Bam H I,Alu I,Bgl I,Eco R I,Hind ,Sal I,Sma I,四核苷酸，平端切口,六核苷酸，平端切口,六核苷酸，粘端切口,六核苷酸，粘端切口,六核苷酸，粘端切口,六核苷酸，粘端切口,六核苷酸，粘端切口,限制性内切酶的命名和意义,Eco R I,序号,属名,种名,株名,例：Eco R I，这是从大肠杆菌（Ecoli）R菌珠中分离出的一种限制性内切酶,限制性内切酶是分析染色体结构、制作DNA限制图谱、进行DNA

8、序列测定和基因分离、基因体外重组等研究中不可缺少的工具，是一把天赐的神刀，用来解剖纤细的DNA分子。,限制性核酸内切酶的类型,首先由M. Meselson和R. Yuan在1968年从大肠杆菌 B株和 K株分离的。,（1）识别位点序列,EcoB： TGA(N)8TGCT EcoK：AAC(N)6GTGC,1. I型限制性内切酶,如 EcoB和 EcoK。,未甲基化修饰的特异序列。,需ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。,（3）作用机理,在距离特异性识别位点约10001500 bp处随机切开一条单链。,Recognize site,cut,1-1.5kb,（2）切割位点,首先由H.O.

9、Smith和K.W. Wilcox在1970年从流感嗜血菌中分离出来。,（1）识别位点序列,未甲基化修饰的双链DNA上的特殊靶序列（多数是回文序列）。 与DNA的来源无关。,2. II类限制性内切酶,分离的第一个酶是Hind ,（2）切割位点,切开双链DNA。形成粘性末端（sticky end）或平齐末端（blunt end）。如：,识别位点处。,（3）粘性末端（sticky ends，cohensive ends）,含有几个核苷酸单链的末端。,分两种类型：, 5端凸出（如EcoR I切点）,GAATTC,CTTAA G,G AATTC,CTTAAG,5-,-3,3-,-5,5-,-3,3-,

10、-5,CTGCAG, 3端凸出（如Pst I切点）,GACGTC,5-,-3,3-,-5,5-,-3,3-,-5,CTGCA G,G ACGTC,3. III类限制性内切酶,在完全肯定的位点切割DNA，但反应需要ATP、 Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。,用途不大。,EcoP1: AGACC,EcoP15: CAGCAG,限制性核酸内切酶的类型,主要特性 I 型 II 型 III 型,限制修饰,多功能,单功能,双功能,蛋白结构,异源三聚体,同源二聚体,异源二聚体,辅助因子,ATP Mg2+ SAM,ATP Mg2+ SAM,Mg2+,识别序列,TGAN8TGCT,旋转对称序列,GAGCC,

11、AACN6GTGC,CAGCAG,切割位点,距识别序列1kb处,识别序列内或附近,距识别序列下游,随机性切割,特异性切割,24-26bp处,第二节 核苷酸的生物降解,核酸的分解代谢,一、核苷酸的降解 1、核苷酸酶 （磷酸单脂酶） 水解核苷酸，产生核苷和磷酸。 非特异性磷酸单酯酶：不论磷酸基在戊糖的2、3、5，都能水解下来。 特异性磷酸单酯酶：只能水解3核苷酸或5核苷酸（3核苷酸酶、5核苷酸酶）。,2、核苷酶 核苷磷酸化酶：广泛存在，反应可逆。, 核苷水解酶：主要存在于植物、微生物中，只水解核糖核苷，不可逆。,核酸,核酸酶,单核苷酸,磷酸单脂酶,核苷,嘧啶（嘌呤）,核糖（脱氧核糖）,核苷酶,核苷

12、磷酸化酶,嘧啶（嘌呤）,核糖-1-磷酸,脱氧核糖-1-磷酸,核糖-5-磷酸,磷酸戊糖途径,醛缩酶,乙醛,甘油醛-3-磷酸,二、嘌呤碱的降解 首先在各自的脱氨酶的作用下水解脱氨，脱氨反应可发生在嘌呤碱、核苷及核苷酸水平上。,不同种类的生物分解嘌呤碱的能力不同，因此，终产物也不同。 排尿酸动物：灵长类、鸟类、昆虫、排尿酸爬虫类 排尿囊素动物：哺乳动物（灵长类除外）、腹足类 排尿囊酸动物：硬骨鱼类 排尿素动物：大多数鱼类、两栖类 某些低等动物能将尿素进一步分解成NH3和CO2排出。,植物分解嘌呤的途径与动物相似，产生各种中间产物（尿囊素、尿囊酸、尿素、NH3）。 植物的嘌呤的分解主要是在衰老叶子及储

13、藏性的胚乳组织内，在胚和幼苗内不发生嘌呤的分解。当叶子进入衰老期，核酸发生分解，生成的嘌呤碱进一步分解为尿囊酸，然后从叶子内运输出并储藏起来，供来年生长用。这表明植物与动物不同，植物有保存并利用同化氮的能力 微生物分解嘌呤类物质，生成NH3、CO2及有机酸（甲酸、乙酸、乳酸、等）。,痛风(Gout),嘌呤碱分解代谢产生过多的尿酸正常人血浆中尿酸含量为20-60mg/L，超过80mg/L时，由于其溶解性很差，易形成尿酸钠结晶，沉积于男性的关节、软组织、软骨、肾等 部位,导致关节炎、尿 路结石以及肾脏疾病， 引起疼痛或灼痛,即“痛 风症”。 摄取大量嘌呤食物或尿 酸排泄障碍时易患痛风症。,痛风的尿

14、酸钠晶体,三、嘧啶碱的降解 人和某些动物体内脱氨基过程有的发生在核苷或核苷酸上。脱下的NH3可进一步转化成尿素排出。,第三节 核苷酸的生物合成,核苷酸的合成途径一般有两条： 1、从头合成：从最简单的原料如CO2、氨基酸、甲酸盐等开始组装碱基环。 2、补救途径：从来自核酸降解的中间产物或外源核苷、碱基直接合成核苷酸，不需组装碱基环。,一、核糖核苷酸的合成 （一）嘌呤核苷酸的合成 1、从头合成 由5-磷酸核糖-1-焦磷酸（5-PRPP）开始，先合成次黄嘌呤核苷酸，然后由次黄嘌呤核苷酸（IMP）转化为腺嘌呤核苷酸和鸟嘌呤核苷酸。 嘌呤环合成的前体：CO2 、甲酸盐、Gln、Asp、Gly,1） 次黄

15、嘌呤核苷酸的合成（IMP）,总反应式： 5-磷酸核糖 + CO2 + 甲川THFA + 甲酰THFA + 2Gln + Gly + Asp + 5ATP IMP + 2THFA + 2Glu + 延胡索酸 + 4ADP + 1AMP + 4Pi + PPi,IMP的合成 （1）5-磷酸核糖焦磷酸（PRPP）的生成起始步骤 磷酸核糖焦磷酸合成酶催化5-磷酸核糖和ATP生成。,（2）5-磷酸核糖焦磷酸与谷氨酰胺反应生成5-磷酸核糖胺、谷氨酸和无机焦磷酸。催化此反应的酶是磷酸核糖焦磷酸酰胺基转移酶。,（3）5-磷酸核糖胺在ATP参与下与甘氨酸合成甘氨酰胺核苷酸。催化此反应的酶是甘氨酰胺核苷酸合成酶。

16、,（4）甘胺酰胺核苷酸在甘胺酰胺核苷酸甲酰基转移酶作用下生成甲酰甘胺酰胺核苷酸。,（5）甲酰甘胺酰胺核苷酸与谷氨酰胺、ATP作用，闭环之前在第3位上加上氮原子。催化此反应的酶是甲酰甘氨咪唑核苷酸合成酶。,（6）闭环 在氨基咪唑核苷酸合成酶作用下生成5-氨基咪唑核苷酸。,（7）六员环的合成开始 在氨基咪唑核苷酸羧化酶催化下， 5-氨基咪唑核苷酸与二氧化碳生成5-氨基咪唑-4-羧酸核苷酸。,（8）嘌呤环的第1位氮的固定 在氨基咪唑琥珀酸氨甲酰核苷酸合成酶催化下， 5-氨基咪唑-4-羧酸核苷酸与天冬氨酸和ATP生成5-氨基咪唑-4-琥珀酸甲酰胺核苷酸。,（9）脱掉延胡索酸 反应由腺甘酸裂解酶催化。生

17、成5-氨基咪唑-4-甲酰胺核苷酸和延胡索酸。,（10）嘌呤环上最后的碳原子由甲酰基供给。催化此反应的酶是氨基咪唑酰胺核苷酸甲酰基转移酶。,（11）脱水环化 在次黄苷酸环水解酶作用下脱水环化生成次黄嘌呤核苷酸（IMP）。,2） 腺嘌呤核苷酸的合成（AMP）,3）鸟嘌呤核苷酸的合成,4）AMP、GMP生物合成的调节 5-磷酸核糖焦磷酸转酰胺酶是关键酶，可被终产物AMP、GMP反馈抑制。 AMP过量可反馈抑制自身的合成。 GMP过量可反馈抑制自身的合成。,嘌呤核苷酸的相互转变, 嘌呤核苷酸是在磷酸核糖分子上逐步合成的。 先合成IMP再转化生成AMP、GMP。 IMP的合成需5个ATP，6个高能磷酸键

18、。 AMP或GMP的合成又需1个ATP。,嘌呤核苷酸从头合成特点,2、 补救途径 利用已有的碱基和核苷合成核苷酸 1）磷酸核糖转移酶途径（重要途径） 嘌呤碱和5-PRPP在特异的磷酸核糖转移酶的作用下生成嘌呤核苷酸,2）核苷激酶途径 腺嘌呤在核苷磷酸化酶作用下转化为腺嘌呤核苷，后者在核苷磷酸激酶的作用下与ATP反应，生成腺嘌呤核苷酸。,合成过程,补救合成的生理意义,补救合成节省从头合成时的能量和一些氨基酸的消耗。 体内某些组织器官，如脑、骨髓等只能进行补救合成。,自毁容貌症,一种X-连锁隐性遗传缺陷疾病，见于男性。由于遗传缺陷导致次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）缺失所致。患者表现为

19、尿酸增高及神经异常。如脑发育不全、智力低下、攻击和破坏性行为、常咬伤自己的嘴唇、手和足趾，故称自毁容貌症。,（二）嘧啶核苷酸的合成,1、 从头合成 与嘌呤核苷酸合成不同，在合成嘧啶核苷酸时，首先合成嘧啶环，再与磷酸核糖结合，生成尿嘧啶核苷酸，最后由尿嘧啶核苷酸转化为胞嘧啶核苷酸和胸腺嘧啶脱氧核苷酸。 合成前体：氨甲酰磷酸、Asp （嘧啶环的元素来源）,1）尿嘧啶核苷酸的合成,氨甲酰磷酸的合成：,2）胞嘧啶核苷酸的合成 尿嘧啶核苷三磷酸可直接与NH3（细菌）或Gln（植物）反应，生成胞嘧啶核苷三磷酸。,3）嘧啶核苷酸生物合成的调节（大肠杆菌） 大肠杆菌嘧啶核苷酸生物合成的调节 氨甲酰磷酸合成酶：

20、 受UMP反馈抑制 天冬氨酸转氨甲酰酶：受CTP反馈抑制 CTP合成酶： 受CTP反馈抑制,2、 补救途径 1）嘧啶核苷激酶途径（重要途径） 嘧啶碱与1-磷酸核糖生成嘧啶核苷，然后由尿苷激酶催化尿苷和胞苷形成UMP和CMP。,2）磷酸核糖转移酶途径（胞嘧啶不行）,二、脱氧核苷酸的合成 脱氧核糖核苷酸是由相应的核糖核苷酸衍生而来的。 腺嘌呤、鸟嘌呤和胞嘧啶核糖核苷酸经还原，将核糖第二位碳原子的氧脱去，即成为相应的脱氧核糖核苷酸。 胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸：先由尿嘧啶核糖核苷酸还原形成尿嘧啶脱氧核糖核苷酸，然后尿嘧啶再经甲基化转变成胸腺嘧啶。,（一） 核糖核苷酸的还原 ADP、GDP、CDP、UDP

21、均可分别被还原成相应的脱氧核糖核苷酸：dADP、dGDP、dCDP、dUDP等，其中dUDP甲基化，生成dTDP。 还原反应一般在核苷二磷酸（NDP）水平上进行，ATP、dATP、dTTP、dGTP是还原酶的变构效应物，个别微生物（赖氏乳菌杆菌）在核苷三磷酸水平上还原（NTP）。,1、核苷酸还原酶系 由硫氧还蛋白、硫氧还蛋白还原酶和核苷酸还原酶（B1、B2）三部分组成。 另外核苷酸还原酶所需的还原当量还可来自谷胱甘肽。 硫氧还蛋白 -SH 硫氧还蛋白还原酶、辅酶FAD 谷胱甘肽氧还蛋白（酶） 谷胱甘肽还原酶 -SH 核苷酸还原酶（RR）-SH,核糖核苷酸的还原反应,核糖核苷酸还原酶,2、核苷酸

22、还原酶结构模型及催化机理 （1）结构模型 B1、B2亚基结合后，才具有催化活性。 B1上的巯基和B2上的酪氨酸残基是活性中心的催化基因。 B1亚基上有两个调节部位，一个影响整个酶的活性（一级调节部位），另一个调节对底物的专一性（底物结合部位） 一级调节部位：ATP是生物合成的信号分子，而dATP是核苷酸被还原的信号。 底物调节部位：与ATP结合，可促进嘧啶类的UDP、CDP还原成dUDP、dCDP；与dTTP或dGTP结合，可促使GDP（ADP）还原成dGDP（dADP） （2）催化机理 自由基催化转换模型。,核糖核苷酸还原酶示意图,底物特异性调节位点,酶 活 性调节位点,活性位点,R1亚基,

23、R2亚基,3、脱氧核苷酸的补救途径（脱氧核苷激酶途径） 脱氧核苷酸也能利用已有的碱基或核苷进行合成（补救途径），但只有脱氧核苷激酶途径，不存在类似的磷酸核糖转移酶途径,（二） 胸腺嘧啶脱氧核苷酸的合成 由尿嘧啶脱氧核苷酸（dUMP）经甲基化生成。 Ser提供甲基，NADPH提供还原当量。,胸腺嘧啶核苷酸合成酶,NADPH + H+ + Ser,NADP+ + Gly,二氢叶酸还原酶,Ser羟甲基转移酶,O,N,HN,O,dR-P,CH3,O,N,HN,O,dR-P,dUMP,dTMP,UMP,UDP dUDP UTP dUMP CTP TMP,核苷二磷酸还原酶,TMP合成酶 甲基化,ATP ATP ATP Gln Mg+,CTP合成酶,磷酸 激酶,dCMP,脱氨基,*核苷酸从头合成的抗代谢物,抗代谢物即代谢抑制物（剂），都是与代谢物在结构上的类似物。它们在代谢反应中跟正常的代谢物相拮抗，以减少正常代谢物参加反应的机会，从而影响正常代谢。 核苷酸从头合成的抗代谢物以竞争性抑制或“以假乱真”方式干扰或 阻断核苷酸的合成代谢,进而阻