第四章-植物组织培养拓展技术.ppt

1、第4章 植物组织培养拓展技术,4.1 细胞培养,细胞培养是将从植物的培养物游离的细胞或细胞团，在人工培养基上进行的培养的方法。通过细胞继代培养，使细胞不断增殖，还能使高等植物的单个细胞经过离体培养后细胞分裂形成细胞团，再经过细胞分化最后产生完整的植株。,4.1.1 单细胞的分离,4.1.1.1 机械分离 先将植物叶片取下经过无菌处理后，在研钵中轻轻研碎，经过一定孔径的纱布或不绣钢滤网过滤，取出过滤后的研磨介质经过低速离心等其他处理使细胞得到纯化。 4.1.1.2 酶解分离 用纤维素酶和果胶酶等酶液处理适合植物外植体即可得到所需要的单细胞。 4.1.1.3 由组织培养物分离 离体培养的愈伤组织分

2、离单细胞。,机械分离法和酶解分离法的比较,机械法,酶解法,细胞受到酶的伤害； 要质壁分离； 细胞产量高； 细胞不易破。,细胞不受到酶的伤害； 机械法不用质壁分离； 细胞产量低； 细胞易破。,4.1.2 单细胞的培养,4.1.2.1 看护培养法 含义：用一块活跃生长的愈伤组织块来看护单个细胞，并使其生长和增殖的方法。 用途：诱导形成单细胞系。 要求：看护愈伤组织处于活跃生长状态；愈伤组织和所要培养的细胞可以是同一个物种也可以不同。,看护培养的方法,（1）在一个培养瓶中加入一定量厚的固体培养基，灭菌后备用。 （2）无菌条件下，将一小块活跃生长的愈伤组织接种到培养基上，再在愈伤组织块上放一片已灭菌的

3、滤纸，然后放置一个晚上。 （3）将分离的单个细胞接种到培养基的滤纸上。 （4）恒温培养。,4.1.2.2 微室培养法,含义：人工制造一个小室，将单细胞接种在小室的微量培养基中。 用途：主要用来观察细胞生长、分裂、形成细胞团的过程。 特点：在培养过程中可以连续进行显微观察，将一个细胞的生长、分裂和形成细胞团的全部过程记录下来。,微室培养的方法,先将先由愈伤组织培养诱导，经液体培养基培养制得单细胞悬浮液备用。在无菌条件下，按盖玻片大小在无菌载玻片上涂一圈四环素眼药膏。将制得的单细胞悬浮液中取出一滴3ml只含一个单细胞的培养液，滴在圈内的载玻片上，然后在药膏上放一小段已消毒的毛细玻璃管，将无菌盖玻片

4、盖在涂有一圈药膏的载玻片上，轻压使其与药膏紧密接触，使盖玻片与载玻片之造成一密封的小室。,4.1.2.3 平板培养法,含义：把单个细胞与融化的琼脂培养基均匀混合，并平铺一薄层(1mm)在培养皿底上的培养方法。 用途：是为了分离单细胞无性系，研究其生理、生化的遗传上的差异而设计的一种单细胞培养技术。广泛应用于细胞、原生质体及融合产物的培养。 特点：可以定点观察；分离单细胞系比液体浅层培养容易；培养细胞气体交换不畅。,4.1.3 细胞悬浮培养,细胞悬浮培养是将游离细胞或细胞团按一定密度，悬浮在液体培养基中不断地搅拌或振荡培养，可以使培养细胞快速大量增殖。 4.1.3.1 分批培养 含义：分批培养是

5、指将一定量的细胞或细胞团分散在一定量的液体培养基中进行培养。 目的：建立单细胞培养物。,4.1.3.2 连续培养,含义：连续培养过程中，不断注入新鲜培养基，排掉等体积的用过的培养基，培养液中的营养物质得到不断补充。 目的：连续培养是植物细胞培养技术中的一项重要进展，它对于植物细胞代谢调节的研究，对于决定各个生长限制因子对细胞生长的影响，特别是对于次生物质的大量生产等具有一定意义。,4.1.3.3 细胞悬浮培养的应用,悬浮培养的单细胞系是突变体育种的良好材料； 人工种子和快速繁殖上的应用； 种质保存当中的应用； 遗传转化的良好受体，转基因技术的应用； 工业方面一是生产植物次生代谢产物，二是用于生

6、物转化，得到期望的天然化合物。,4.2 原生质体培养,原生质体培养的意义： （1）在植物遗传育种实践方面意义重大。 （2）由于没有细胞壁，有利于进行体细胞诱导融合和单细胞培养。 （3）可用于细胞表面的结构与功能的研究，细胞器结构与功能的研究，病毒侵染与复制机理的研究，细胞核与细胞质相互关系，植物生长物质的作用、植物代谢等生理问题的研究。,4.2.1 原生质体分离,材料的选择： 叶肉细胞是分离原生质体的最好的细胞材料，取生理状态适宜的叶片，有利于原生质体的细胞再生和细胞分裂。 酶： 分离原生质体最常用的酶有纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶。,4.2.2 原生质体的培养,4.2.2.1 固体培养法 将

7、悬浮在液体中的原生质体悬液与热融的含琼脂的培养基等量混合，使琼脂的最终浓度为0.6左右，冷却后原生质体包埋在琼脂培养基中。,4.2.2.2 液体培养 在培养基中不加凝胶剂，原生质体悬浮在液体培养基中。 4.2.2.3 固液结合培养法 在培养皿的底部先铺一薄层含凝胶剂的固体培养基，再在其上进行原生质体的液体浅层培养。,4.2.3 细胞融合,4.2.3.1 融合方式 主要是用各种化学试剂作为诱导剂，常用的方法有高钙高pH法、聚乙二醇(PEG)法。 4.2.3.2 融合过程 异种原生质体先经膜融合形成共同的质膜，然后经胞质融合，产生细胞壁，最后是核融合。,4.3 花药和花粉培养,植物的花粉:是花粉母

8、细胞经减数分裂形成的，其染色体数目只有体细胞的一半，叫做单倍体细胞。 花粉和花药的培养:是指花粉在培养基上改变其正常发育和机能，不经受精而发生细胞分裂，由单个花粉粒发育成完整植株的技术。 单倍体植物：用离体培养花药的方法使花粉发育成一个完整的植株。,4.3.1 花药培养,4.3.1.1 花药材料的选择 选择大致处于所需要时期的花蕾。由于花粉发育时期和植株的某些外部形态特征之间的大致相关性，因此利用这些外部标志，选择符合条件的花蕾，经镜检确定花粉发育的准确时期。,4.3.1.2 培养基的选择,花药培养所采用的培养基是MS、N6、B5等。添加的激素有6-BA、KT和玉米素，2，4-D，NAA和IA

9、A等。诱导愈伤组织的培养基可添加2，4-D，其浓度为1-3mgL，分化培养基可添加2-3mgL的BA，再加少许的IAA(0.2-0.5mgL)，生根培养基可单独添加生长素(0.5-lmgL)。,4.3.1.3 消毒接种培养,表面消毒：常以70%酒精棉球擦拭材料外表或浸润片刻即可。 接种：在超净工作台上用镊子剥去部分花冠，露出花药，夹住花丝，取出花药接种到培养基上。 培养：将培养材料置于2528，光照强度200010000lx，光照时间1218h/d。,4.3.1.4 药培养中的花粉发育过程,（1）营养细胞发育途径 （2）生殖细胞发育途径 （3）营养细胞和生殖细胞同时发育的途径 （4）花粉均等分

10、裂途径,4.3.2 花粉培养,花粉培养是指把花粉从花药中分离出来，以单个花粉粒作为外植体进行离体培养的技术。由于花粉已是单倍体细胞，诱发它经愈伤组织或胚状体发育成的植株都是单倍体植株。且不受花药的药隔、药壁、花丝等体细胞的干扰。但缺点是较比花粉培养难度大。,4.3.2.1 花粉的分离 将花药放到加有基本培养基的小烧杯中，用注射器的内管在烧杯的壁上挤压花药，使花粉从花药中释放出来。 4.3.2.2 花粉的预处理 （1）低温处理 （2）重力的作用,4.3.2.3 培养基成分 选用Nitsch作基本培养基，含有诸如硝酸钙、硫酸、柠檬酸铁、酵母浸出液和椰子胚乳等 。 4.3.2.4 花粉培养方法 （1

11、）微室培养法 （2）看护培养法,4.3.3 花粉植株的鉴定与染色体加倍,4.3.3.1 花粉植株鉴定 （1）细胞学鉴定上 （2）流式细胞分析法 （3）气孔大小及保卫细胞叶绿体数目鉴定 （4）植株形态指标鉴定上,4.3.3.2 花粉植株染色体加倍,(1)自然加倍：通过花粉细胞核有丝分裂或核融合染色体可自然加倍，从而获得一定数量的纯合二倍体。 (2)人工加倍：用秋水仙素处理单倍体植物，使染色体加倍的方法。处理方式有秋水仙素溶液浸苗、处理愈伤组织和用含0.4%秋水仙素的羊毛脂涂抹田间单倍体植株的顶芽、腋芽等，处理时间和秋水仙素的浓度视材料而定。,4.4 胚胎培养,植物胚胎培养是胚及胚器官(如子房、胚

12、珠)在离体无菌条件下，使胚发育成幼苗的技术。包括幼胚培养、成熟胚培养、胚珠培养、子房培养、胚乳培养等。,4.4.1 胚培养,4.4.1.1 培养类型 (1)成熟胚培养：培养较易成功，将其置于只含有大量元素和糖的较简单培养基中，仅需提供一定的温度、湿度就可以正常萌发长成植株。 (2)幼胚培养：幼胚从生理至形态均未成熟，培养时完全依赖和吸收周围组织的有机营养物质，对培养基要求较高，仅提供一定的温度和湿度均不能使其萌发，培养难度较大。,4.4.1.2 培养过程,（1）培养基 （2）生长调节物质 （3）天然提取物的作用 （4）温光条件 （5）其他条件,4.4.2 胚乳、胚珠和子房培养,4.4.2.1

13、胚乳培养 将胚乳从母体上分离出来，放在无菌的人工环境条件下，让其进一步生长发育，以至形成幼苗的过程。 4.4.2.1 胚珠和子房培养 胚珠或授粉子房培养，合子胚可以更好地发育成植株。但如果条件不适，也容易从幼胚或珠心组织产生愈伤组织。,4.5 种质资源的离体保存,种质资源离体保存是指在离体条件下，将单细胞、原生质体、愈伤组织、悬浮细胞、体细胞胚、试管苗等植物组织培养物，置于抑制其生长的无菌条件下，达到长期保存的方法。,4.5.1 种质资源离体保存的意义,离体保存具有省时、省地、省力，不受环境因素的影响，便于植物资源的交换等优点。 离体保存的目的是保持培养物不死亡、不变异、不被污染，在需要时可重

14、新恢复。,4.5.2 种质资源离体保存的方法,4.5.2.1 植物种质资源的常温限制生长保存 （1）常温限制生长保存的概念 通过提高渗透压、添加生长延缓剂或抑制剂 、干燥、降低气压、改变光照条件等，限制培养物的生长，使转移继代的间隔时间延长达到保存种质的方法。 （2）常温保存的方法和原理 高渗保存法。 生长抑制剂保存法。 抑制生长的其他保存法。,4.5.2.2 植物种质资源的低温保存,（1）低温保存的概念 低温使植物生长速度就会受到抑制而减慢，老化程度延缓，因而延长了继代的时间间隔而达到保存种质的目的。 （2）低温保存的方法和原理 控制保存材料所处的温度和光照。06适宜保存温带起源植物的试管苗

15、，1520可用于热带植物试管苗的保存。 （3）超低温保存的基本程序 包括培养物的选取、材料预培养、冷冻、贮存、解冻、再培养等。,4.5.2.3 植物种质资源的超低温保存,（1）种质资源超低温保存的概念 超低温保存也叫冷冻保存，是将植物的离体材料经过一定的方法处理后，在超低温(-196液态氮)条件下进行保存的方法。 （2）种质资源超低温保存的原理 保存在液氮中的植物细胞代谢活动、生长基本停止，因而排除了遗传性状的变异，同时保存细胞的活力和形态发生潜能。,4.6 人工种子,4.6.1 人工种子的意义 人工种子是细胞工程中最年轻的一项新兴技术。最初是由英国科学家于1978年提出的。他认为利用体细胞胚

16、发生的特征，把它包埋在胶囊中，可以形成具有种子的性能并直接在田间播种。,4.6.2 人工种子主要优点,培养条件可以人为控制，免遭大自然灾害性气候的不利因素,繁殖量大、快速繁殖性状优良、遗传性稳定的植物品种。 大量繁殖无病毒材料，以提高植物抗性、产量和商品品质 对生育周期长的多年生植物、育性不良的难于有性繁殖的植物可用人工种子技术进行繁殖。 人工种子体积小，贮藏运输方便。 人工种子如天然种子一样，具有坚硬的种皮，适于机械化播种。,4.6.3 人工种子的结构,4.6.3.1 体细胞胚 4.6.3.2 人工胚乳 4.6.3.3 人工种皮,人工种子结构示意图,4.6.4 人工种子包埋方法,4.6.4.

17、1 干燥包理法 23，相对湿度为70土5，黑暗条件下逐渐干燥。 4.6.4.2 液胶包理法 将胚状体悬浮在一种黏滞的流体胶中，直接插入土壤。 4.6.4.3 水凝胶法 用海藻酸钠等水溶性凝胶经与钙离子进行离子交换后凝固。,4.6.5 人工种子基本制作流程,人工种子基本制作流程,4.6.6 人工种子的分类,裸露的或休眠的繁殖体：如可以适当干燥的体细胞胚（如鸭毛草的体细胞胚）、休眠的微鳞茎和微块茎等 。 人工种皮包被的繁殖体：一些体细胞胚、原球茎等。 水凝胶包埋再包被人工种皮的繁殖体：大多数体细胞胚、不定芽、茎尖。,4.6.7 人工种子的贮藏与萌发,人工中子的贮存方法有：低温法、干燥法、抑制法、液体石蜡法等，以干燥和低温结合应用最多,4.6.8 人工种子的转换试验,4.6.8.1 无菌条件的转换 4.6.8.2 土壤条件的转换 （1）无土培养试验 （