MDCK细胞分离流感病毒ppt课件

1、学习流感病毒细胞分离培养、1、交流PPT、1、组织培养概况；(1)组织培养定义组织或细胞培养是指从机体中提取组织或细胞，在体外培养模拟机内的生理条件，使其生存和生长。 2、学习交流PPT、(2)、组织培养原理，组织培养主要为病毒敏感组织细胞提供良好的生存环境，使细胞适应环境，获得生长繁殖能力。 病毒在敏感细胞中繁殖，多引起细胞代谢等变化，可引起细胞病变，将病毒释放到维持液中，这种情况可通过细胞病变、色变法和检测维持液中病毒抗原的方法，判断病毒的存在和滴度。 有些病毒不引起细胞病变，在核内繁殖难以释放到维持液中。 前者可以用干扰的方法和免疫荧光的方法检测病毒，后者多以冻融破坏细胞获得病毒进行检测

2、。 3、交流PPT，(3)、学习组织培养所需的材料和条件，1、组织或细胞源：人、猿、啮齿类、鸟胚胎、器官及昆虫等是组织培养中常见的组织源。 用于病毒培养的多为病毒的自然宿主细胞。 例如人病毒对人和猴的组织很敏感，但是有些病毒对其他宿主细胞也很敏感，例如b脑病毒比蚊细胞系C6/36对人的细胞更敏感。 流感病毒对犬肾继代细胞(Madin darby canine kidney，MDCK )也很敏感。 4、学习交流PPT，2、单细胞制备(简称)，5、学习交流PPT，3细胞培养的基本条件： (1)细胞接种数：细胞量越大繁殖速度越快，接种传代细胞一般为1030万/ml。 (2)合成培养液： Eagle氏

3、液、RPMI1640、Eagles MEM等。 不同培养液各有特点，但通常适用于各种细胞培养，其主要成分为氨基酸、碳水化合物、维生素、无机盐及其他成分。 制备培养液的水通常使用单蒸发的去离子水。 合成培养液中不含蛋白质成分，血清蛋白质不仅促进组织培养中不可缺少的细胞生长，而且可以帮助贴壁，根据血清对细胞的促进作用不同，牛胎儿血清最好，在使用各批血清前需要5630分钟进行灭活处理。 含有10%血清的培养液促进细胞增殖，称为生长液。 6、学习交流PPT，(3)酸碱度：细胞生长最佳PH范围为7.07.4。 培养环境的偏酸比甲碱更适合细胞壁粘贴。 PH值的变化主要取决于HCO3-浓度、二氧化碳分压和细

4、胞糖代谢能力。 使用二氧化碳培育箱，可以提供稳定的5%的二氧化碳。 可以自动调节细胞代谢引起的PH变化。 (4)温度：细胞培养的最佳温度与来源于细胞的动物体温一致，温度上升23会对细胞产生不良影响，在24h内死亡。 低温对细胞的影响很小。 7、学习交流PPT (5)无菌条件：细胞培养的关键之一是无菌概念，防止污染。 在细胞培养中，有可能发生污染的来源很多，有组织培养液、器皿、组织本身、作业者本身、空气等。 因此，培养液、器具、操作室必须彻底消毒，操作时严格实施无菌操作。 (6)培养器的处理：培养器的处理好坏对细胞的贴壁生长有很大影响。 常用的器皿主要有玻璃和塑料两种。 玻璃容器一般要用洗涤液浸

5、泡一晚，用清水洗涤10次后，用蒸馏水洗涤2次，干燥后预备。 塑料板通常在2%NaOH中浸渍1小时后，用清水清洗，再用1N HCl浸渍1小时，用清水清洗后用蒸馏水冲洗即可。 37干燥后，用紫外线照射消毒。 (8)学习交流PPT，(4)组织培养的优缺点及应用范围：优点：能以大量生物性状相同的细胞为研究对象，对疫苗生产来说，其抗原性接近自然流行株，可减少宿主蛋白成分，减少过敏反应。 缺点：病毒复制后滴度低，不易保存，保存时易失去病毒滴度，传代细胞含有致癌因子，不适于疫苗生产。随着细胞代数的增加，对病毒的敏感性也降低。 应用范围：目前组织培养技术已应用于病毒学各部门，不仅应用于病毒性疾病的诊断和疫苗制

6、造，也深入地应用于病毒学基础理论的研究，学习9，交流PPT，2，组织培养分离流感病毒，流感监测的最主要目的立即有意义组织培养技术是分离，是诊断流感病毒最常用、最可靠的方法之一。 人流感病毒最初是由水貂分离出来的，但由于水貂繁殖慢、量少、价格昂贵、饲养困难，因此不能广泛应用。 从20世纪30年代开始，多用鸡胚分离流感病毒。 学习交流PPT，最近PCR技术突发发展，发现鸡胚分离的流感病毒，其抗原性与原始标本不同，MDCK细胞分离，其抗原性与原始标本相似。 最近，由于“o”相毒株的再现，MDCK等部分细胞对“o”相毒株的敏感性大大高于鸡胚的敏感性。 因此，MDCK等一部分细胞成为各流感病毒检测分离不

7、可或缺的宿主系统。 MDCK等一些传代细胞为肿瘤细胞系，因其分离的病毒不能用于疫苗制备，在进行流感病毒检测分离时，要求同时采用鸡胚和MDCK细胞。 学习11、交流PPT，(MDCK细胞分离流感病毒1，实验材料：MDCK细胞(优选早代) Eagle氏培养液(优选日本产的含谷氨酰胺吸滤) Hank氏溶液0.25%胰酶和Versene消化液两抗(蓝，链霉素) 或庆大霉素和抗真菌胎牛或小牛血清5.6%或7.5%)细胞生长液制备90ml Eagles液的最终浓度为100u/ml青霉素和100ug/ml链霉素10ml的小牛血清2ml 5.6%NaHCO3 PH为7.5%。 (2)细胞维持液制备了：同生长液

8、，不含牛胎儿和牛胎儿血清，含最终浓度为23ug/ml的胰蛋白酶，以前用NaHC03将PH调至中性或甲碱。 维持液的作用是停止细胞的繁殖，但维持代谢。 学习了13、交流PPT、2、MDCK细胞传代，(1)将必要的Eagles和Versene放入37水浴预备温度中，不要放入其试剂。 (2)切断的MDCK细胞放弃其生长液。 用Versene洗两次。 (以Versene和0.25%胰酶71为消化液。 (4)放置37恒温槽510min，细胞变圆，表示细胞和细胞之间不再相互关联，消化时间到了。 如果细胞还被切断，表示消化时间还没有到。 (5)倒掉消化液，瓶子里留点流体，放入37 23，取出手轻轻敲打，加上

9、此时配合的生长液，稍微吹一下即可。 一般来说，每1个细胞有3个，每23天传代一次。 学习14、交流PPT、3、MDCK细胞的保存和复苏，MDCK细胞对流感病毒的敏感性随代数的增加而下降，所以各实验室应以液氮冻存代数低的细胞为种子。 一般的保存液含有10%的二甲亚砜和90%的小牛血清。 (1)MDCK细胞保存：将单层细胞消化分散制成单细胞，放入0.9ml小牛血清和0.1ml二甲基亚砜的混合保存液，每瓶放入1ml保存液，缓慢冷冻保存：先放入42h，704h，放入液氮中长期保存。 (2)MDCK细胞复苏：将细胞冻存管从液氮罐中取出后，迅速溶解37水浴，1500rpm/分离心1分钟，丢弃上清和沉渣加入

10、数ml培养液，搅拌后装入细胞培养瓶，加入37二氧化碳温箱进行培养。 学习了15、交流PPT、4、MDCK细胞对流感病毒的敏感性测试，MDCK细胞对病毒的敏感性随代数的增加而下降。 因此，当MDCK细胞在实验室中传递20代以上时，需要测试其对流感病毒的敏感性。 其具体测试方法：选择一株对MDCK细胞敏感的流感病毒株。 在相同条件下，用早代和试验的MDCK细胞进行TCLD50测定。 如果测试的TCLD50比上一代Log低两个或更多，请不要使用它，因为它对病毒的敏感性很低。学习16、交流PPT、5、MDCK细胞病毒的接种和收获，(1)低倍光学显微镜下检测MDCK细胞的生长状态。 (2)单片细胞丢弃生

11、长液，用Hanks液洗涤2次，洗涤剩馀牛血清，牛血清中含有流感病毒非特异性抑制素，因此影响流感病毒的复制。 (3)每瓶装入0.5-1.0ml接种标本，轻轻摇动细胞瓶，放置35，吸附12h。 (4)倒掉感染液，再用Hanks液洗涤12次，每瓶加入3ml维持液，用33-35培养。 17、学习交流PPT，(5)从第二天开始每天检查有无细胞病变(CPE )。 CPE的特点是细胞肿胀圆化，细胞间隙增大，细胞核固缩或崩溃，严重时部分或全部细胞脱落(见附图)。 (6)收获及红细胞凝集活性(HA )检查： CPE出现时收获，未能证明CPE是流感病毒引起的。 最后，要观察维持液中是否有红细胞聚集活性(HA )，

12、出现细胞聚集的是阳性标本，也可以收集所有维持液进行病毒鉴定，暂时冷冻保存。 维持液中没有牛血清，同时含有一定量的胰酶和NaHCO3，请不要保存在4中。 如果不这样做，HA活性就会丧失，PH值容易升高。 维持液中加入适量胰酶的目的是提高流感病毒向细胞的复制能力。 (7)传代及盲传：收获的维持液HA滴度不高或量不足时，需在MDCK细胞或鸡胚中传代，提高或增加HA滴度。 18、交流PPT，(二)细胞培养需要注意的几个问题有： 1、消化时间过长(30min-1h )或胰酶保存时间过长，胰酶浓度或二次消化应改变。 2 .细胞的保存问题。 采集早代细胞种子时，必须及时保存以防止遗失和污染。 使用Eagles液之前，请