植物花药培养及单倍体植株鉴定-2015.ppt

1、花药培养和单倍体植株鉴定，20小时，安徽农业大学生命科学学院，高君山，花药培养：指将未成熟花药接种在人工培养基上分化成植株的过程。属于器官培养。常规育种需要4-6年才能获得纯系，而小孢子培养只需要一年。1.实验目的和原理。原理：利用组织培养技术体外培养植物花药，诱导再生植株。单倍体植株通过形态学观察和染色体分析被鉴定为新的遗传资源和选择材料。目的：掌握植物花药离体培养技术；掌握单倍体植株鉴定的方法；理解单倍体育种的重要性。花药培养的基本流程：2 .实验内容1。花粉发育时期的显微镜检查。花药离体培养2.1取样2.2消毒2.3接种2.4培养3。单倍体植株的鉴定。实验设备和材料：烟草花药。试剂：质谱

2、培养基、N6培养基、B5培养基、酒精、2，4-D、NAA、KT、蔗糖、乙酸品红和蒸馏水。仪器：电子天平、磁力加热搅拌器、普通光学显微镜、微波炉、酸度计、培养箱、洁净工作台、高压釜、镊子、剪刀、解剖针、烧杯、试剂瓶、三角瓶、密封膜、橡皮筋、低温冰箱。(4)实验步骤(1)选择合适的花药。花药中的花粉通过减数分裂来自生殖细胞(体细胞)，其染色体只有体细胞的一半。染色体加倍后，获得了纯合二倍体，大大缩短了育种进程。一般来说，单核阶段(第一次有丝分裂前)是最敏感和最好的培养阶段。双核后，胚状体主要由营养细胞在适宜条件下分裂产生。花粉发育阶段：被子植物的花粉发育可分为四个阶段：四分体阶段、单核阶段(小孢子

3、阶段)、二核阶段和三核阶段(雄配子阶段)。四分体检测阶段、单核侧体阶段、花药切片显微观察、四分体：品红醋酸染色、四分体： Alexanders染色、单核阶段、双核阶段、成熟花粉粒和烟草花粉发育阶段：通常，将植物的花药在载玻片上粉碎，用1-2滴1%品红醋酸染色，然后进行显微检查以确定花粉发育阶段。不同发育阶段的烟草花芽、烟草花粉发育时期的确定、烟草花粉培养以及单核和边缘期花药的选择培养效果最好。从烟草花的外部形态变化来看，当花蕾的花冠长度与花萼长度相等时，花药中的大部分花粉粒处于单核阶段。不同物种诱导胚胎发生的最佳小孢子发育时期。离体花药培养，(1)取材料进行显微镜检查，根据花粉发育时期选择合适

4、大小的花蕾。(考虑到供体植物的基因型和生理状态)(2)用70酒精擦洗芽表面，在1次氯酸钠溶液中浸泡8-10分钟，或在0.1升汞溶液中消毒8-10分钟，用无菌水冲洗3-5次。(3)接种后，剥离萼片和花瓣，取出花药。花丝应该被除去，但是花药不应该被损坏。(4)培养物去分化，直至小孢子分裂形成胚或愈伤组织，并突破花药壁表面形成突起(2-3周)；转入分化培养基中培养，形成小植株。在花药培养过程中，取芽(镜检)、预处理、取花药、接种、预处理和预处理是小孢子培养成功的前提。预处理的目的是改变小孢子的发育方向，使尽可能多的小孢子从配子体发育转变为孢子体发育(即成为具有胚胎发生潜力的小孢子)。适当的预处理可以

5、大大提高绿苗的产量。预处理方法：对花药进行中度胁迫处理，包括低温、高温、化学物质、离心、辐射等。烟草花药培养，4低温预处理2-3天。培养基，主要是MS、h、N6、B5和Nitsch培养基，在此基础上发展了其他一些培养基。培养基(基本成分6-ba/kt 2毫克/升NAA/2，4-d 0.2毫克/升蔗糖30克/升琼脂7克/升活性炭1克/升，酸碱度5.5-5.8)；愈伤组织形成后，将其转移到高浓度培养基(NAA 2毫克/升6-BA 0.2毫克/升20g/升蔗糖7克/升琼脂)中分化成苗。1/2 MS培养基激素蔗糖琼脂活性炭，高浓度NH4显著抑制花粉愈伤组织的形成。铁盐对花粉胚状体的发育非常重要。活性炭

6、促进胚状体发育。较高浓度的蔗糖可以诱导花粉形成愈伤组织；较低的蔗糖浓度可以将愈伤组织分化成幼苗。细胞分裂素能促进胚状体的形成；生长素可以诱导愈伤组织的形成。当细胞分裂素与生长素的比例较高时，愈伤组织可以诱导分化成幼苗。氨基酸有机添加剂，培养基的制备，培养基的制备，培养条件，1。适宜温度为2528，一般不低于25。2.每天照明12小时，光照强度为1800-2000lx。3.接种密度应根据三角瓶的大小来确定。通常，10个花药接种在50毫升三角瓶中。1.胚状体发育途径小孢子经历胚胎发生的不同阶段，最后子叶展开形成花粉植株。2.愈伤组织发育途径小孢子几次分裂形成愈伤组织，然后分化成花粉植株。通过这种途

7、径产生的植物将具有变异和复杂的倍性。花粉植株的形态发生，单倍体植株的发育，胚状体的发育，以及一些花药通过胚状体形成小植株。烟草花药培养：胚状体从开裂的花药中生长；乙、丙：直接从药室培育的幼苗；d和e:有根、茎和叶的幼苗；f:幼苗根系发达，愈伤组织发育途径，部分花药产生愈伤组织，水稻花药接种于平板上，水稻花药培养，愈伤组织移栽至再生培养基，愈伤组织分化形成再生植株，白化苗现象，(1)白化苗产生的影响因素及机理。内部供体植株基因型(如籼稻的白苗率高于粳稻)、花粉发育时期。2.外部因素预处理、培养基组成、激素水平和种类、培养条件和方法、愈伤组织转分化时间等。3.机制核基因起着关键作用，导致质体脱氧核

8、糖核酸和白色幼苗的损失。此外，克隆变异也可能是原因之一。(2)白化苗受花粉发育时期、预处理、培养基成分等因素的控制。单倍体植株的鉴定通过花药培养获得的再生植株的染色体数目经常变化，并且它们的后代经常是混合倍性的，因此有必要鉴定它们的后代。该鉴定方法可以根据形态特征进行间接鉴定，也可以通过显微检查体细胞或花粉母细胞中的染色体数目和染色体配对进行直接鉴定。此外，它可以根据花粉育性或遗传标记性状来鉴定。(1)染色体直接计数法通常是将根尖、茎尖等分生组织用醋酸品红染色切片，直接计数染色体数目。(2)间接鉴定(1)植物形态鉴定方法单倍体植株薄，叶窄，花小，柱头长，花粉粒小，无种子。(2)细胞形态学鉴定方

9、法叶片中保卫细胞的大小、单位面积气孔的数量以及保卫细胞中叶绿体的大小和数量与倍性高度相关。(3)扫描细胞光度术(流式细胞术)主要测定叶片单个细胞中的脱氧核糖核酸含量，以确定细胞的倍性。(4)杂交鉴定法自交或测交鉴定根据后代的分离情况，可确定二倍体植株是来自小孢子还是体细胞。(5)分子标记鉴定包括生化标记(如同工酶标记)和分子标记(如RFLP、RAPD、AFLP等)。)。用醋酸品红染色法观察植物根尖细胞的染色体。实验步骤：1 .材料：烟草根尖。2.预处理：冷冻处理。将根尖放入冰水浴中，并在4的冰箱中放置24小时。3.将洗好的材料用卡诺溶液(冰醋酸无水乙醇=13或冰醋酸氯仿无水乙醇=1)固定；3:

10、 6)固定24小时。4.解离后取出4-5根，放入表镜中，用蒸馏水冲洗3-4次，在表镜中加入几滴1N盐酸，在酒精灯上间歇加热2-4分钟。5.加入几滴醋酸洋红到染色的表镜上，在灯上加热。取一根染色的根，放在载玻片上，加入一滴1%的醋酸洋红溶液，盖上盖玻片，轻轻拍打，使根尖压成一薄层。6.显微镜检查首先发现10次分相，然后观察40次。4.预防措施1。提高诱导效率。2.降低白化苗的频率。五、作业和思考问题1。花药培养的一般程序；附上培养结果(照片)2。影响花药培养的因素；诱导率/%=(愈伤组织数/接种花药数)100出现率/%=(花药出现数/接种花药数)100 3。单倍体植株的鉴定方法；4.单倍体育种的意义和不足。胚状体形成：MS培养基(1/2常