分子生物学--蛋白质.ppt

1、第一章 蛋白质,第一节 蛋白质的元素组成,特点：含氮量较恒定，一般在16%左右 蛋白质系数6.25 蛋白质含量 = 样品含氮量6.25,第二节 氨基酸,非蛋白氨基酸（二百余种）,氨基酸,蛋白氨基酸,基本氨基酸,稀有氨基酸,一、结构特点与分类：,1.结构特点：所有20 种基本氨基酸的结构通式为,特点：-氨基酸 (脯氨酸除外) L-氨基酸（甘氨酸除外）,中文：如 甘氨酸； 英文：三字母符号（Gly）和单字母符号（G）,2.分类：分类原则在生理pH条件下，氨基酸R基的带电性。 据此原理，20种氨基酸共分为四组： 非极性R基氨基酸 极性不带电荷R基氨基酸 带负电荷R基氨基酸 （酸性氨基酸） 带正电荷R

2、基氨基酸（碱性氨基酸）,表示：,3.稀有氨基酸：蛋白质合成后在基本氨基酸基础上经加工修饰而生成的氨基酸。,4羟基脯氨酸,赖氨酸,5羟基赖氨酸,二、必需氨基酸（8种）： 人体不能自我合成，必须从外界中摄取的氨基酸,赖氨酸、苏氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、色氨酸,GO,氨基酸 丙氨酸 缬氨酸 亮氨酸 异亮氨酸 苯丙氨酸 色氨酸 甲硫氨酸 脯氨酸,三字母 符号 Ala Val Leu Ile Phe Trp Met Pro,单字母 符号 A V L I F W M P,非 极 性 R 基 氨 基 酸,结构式,三、氨基酸的理化性质,1.一般性质：溶解度：可溶于水、稀酸、稀碱中 旋

3、光性：丙氨酸 +1.8、半胱氨酸 -16.5、 脯氨酸 -86.0 熔点：大部分在200以上，丙氨酸297、丝氨酸280 2.两性解离和等电点：氨基酸由酸性基团和碱性基团，可以发生两性解离：,等电点定义：某一氨基酸的净电荷等于零时的溶液pH值为该氨基酸的等电点 不同的氨基酸有不同的等电点 等电点时的特点：溶解度下降 用途：可根据氨基酸的等电点来分离不同氨基酸，如味精生产时将pH值调到3.22，谷氨酸沉淀下来。,pI计算法： pI=（pK左+pK右 ）/2 pK左 : pI处左侧pK 值， pK右 :pI处右侧pK 值。 如：甘氨酸的两性解离为：,pK1 =2.34 pk2 =9.60 pI=(

4、2.34+9.60)/2=5.97,赖氨酸的两性解离为：,与等电点有关的pK值为：pK2 =8.95 pK3 =10.53 pI=9.74 一、二、三组氨基酸：pI=（pK1+pK2 ）/2 第四组氨基酸：pI=（pK2 +pK3 ）/2,3.吸收光谱：所有20种基本氨基酸在可见光区都无光吸收，在近紫外区三种芳香氨基酸具有紫外吸收，即：苯丙氨酸257nm、酪氨酸275nm、色氨酸280nm,GO,氨基酸表观解离常数和等电点,用途：可用于氨基酸的定性和定量测定 脯氨酸是亚氨基酸，只有一步反应，反应产物为黄色。,4.氨基酸的重要化学反应 （1）茚三酮反应,（2）Sanger反应 氨基酸与二硝基氟苯

5、（DNFB）反应，生成二硝基苯代氨基酸（DNP氨基酸）,用途：测定肽链N-端氨基酸,（3）Edman反应 异硫氰酸苯酯与氨基酸反应生成PTH氨基酸,用途：蛋白质一级结构序列测定,5.氨基酸的分离方法 （1）分配层析 固定相，流动相,Rf = B/A Rf ：迁移率,层析缸,层析滤纸,层析液,流动相：正丁醇,固定相：水,溶剂前沿,点样线,原点,氨基酸色点,（2）离子交换层析,离子交换剂,配对离子,氨基酸,平衡离子,第三节 肽,一、概念：,二、书写方式：左右，N C，可用英文或中文简写，中间用一短杠相连，氨基端加“H”，羧基端加“OH”，每一个氨基酸要叫氨基酸残基。 例： H-丙-甘-谷-精苯丙-

6、组-OH H-Ala-Gly-Glu-ArgPhe-His-OH,主肽链 多肽链中由共价键连接成的连续的链状结构 肽单位 主肽链中的重复单位,由于有巯基，所以有氧化还原反应 GSH + GSH GSSG + 2H+ +2e- 谷胱甘肽是生物体内重要的氧化还原物质，对细胞起到了保护作用，另外，还是其他细胞保护剂的还原剂,三、重要的寡肽及其作用 谷胱甘肽（GSH）：,第四节 蛋白质结构,一、一级结构：定义：蛋白质的多肽链中氨基酸的排列顺序，包括二硫键位置 特点：基础结构，稳定结构 牛胰岛素的一级结构（局部）：牛胰岛素由A、B两条肽链组成，A链20个氨基酸残基，B链30个氨基酸残基,二、二级结构：（

7、1）概念：二级结构定义在规则氢键指导下局部多肽链在空间的排列方式 由于单键可以自由旋转，所以从理论上说肽链有无数种构象，但实际上，蛋白质的二级结构只有少数几种，这是由于肽链在形成空间结构时要受到多种因素的限制，这些因素有：,肽键平面由于肽键的双键性质，使得形成肽键的N、C原子以及它们相连的四个原子形成一个平面，这个平面就叫肽键平面。,形成的原因：p共轭，肽键不能自由旋转 结果：形成刚性平面,二面角 和两个构象角称为二面角,非键合原子之间最小接触距离 （nm）,非键合原子之间最小接触距离,a螺旋：要点：单链、右旋，一圈3.6残基，上升0.54nm，形成51氢键且全部平行，R基指向外侧,（2）种类

8、（4类）：,折叠：肽链伸展，形成链间氢键（成为片层），R-基处于片层上下,反平行b折叠,折叠有平行和反平行两种, 转角（回折）：肽链180旋转，氢键连接；,无规则卷曲,转角,三、超二级结构：概念：相邻二级结构单元 相互作用形成的聚合体,种类：（A） X(B、C) 曲折（D） 回形拓扑结构(E),四、结构域：概念：蛋白质分子中在空间相对独立的三维实体。,乳酸脱氢酶结构域,刀豆蛋白结构域,弹性蛋白酶三级结构与结构域,免疫球蛋白G,例：肌红蛋白。是肌肉中运输氧的蛋白质，一条肽链，153个氨基酸残基，分子量为16700，含一个血红素辅基，氧分子就结合在它的铁上。整个分子有8个-螺旋，并且有-转角和无规

9、则卷曲，但是无-折叠 。,又如：卵溶菌酶,五、三级结构：定义：蛋白质分子中所有原子的空间排列,特点： 高低不平,IgG的结构,疏密不一 近似球状,醛糖脱氢酶, 外亲内疏,如：血红蛋白含有四个亚基，为22，每个亚基含一个血红素，每个血红素可结合一个氧分子。亚基含141个氨基酸残基，亚基含146个氨基酸残基。,亚基与肽链的区别，亚基 是指寡聚蛋白中非共价连接的亚单位，它可以是一条肽链，也可以是通过共价键连接起来的几条肽链。 亚基和原体 原体是指寡聚蛋白中等同的结构成分，有时原体就是一个亚基，但有时是几个亚基。如血红蛋白的亚基数为四个，但其原体数为二个。,Hemoglobin空间结构,六、四级结构：

10、概念：蛋白质分子中亚基在空间的排列,氢键、盐键、疏水作用力、二硫键、配位键、范德华引力,七、维持蛋白质空间结构的作用力,一、蛋白质的功能：催化、运转、运动、能量交换、免疫、激素、调节、结构、贮存 二、一级结构与功能的关系：一级结构与功能有密切的关系 1. 氨基酸对功能的重要性 如果改变的氨基酸是蛋白质执行功能所必需的，则这种氨基酸的改变对功能的影响极大，如果改变的氨基酸对功能无贡献，则它们的改变基本不影响蛋白质的功能。 如RNA酶，如果将其N-端的三个氨基酸去掉，酶的功能基本不变，但是，如果将组12改变，则酶失去活性。,第五节 结构与功能的关系,镰刀状贫血病：就是由于血红蛋白-链上第六位的谷氨

11、酸被缬氨酸代替，使得血红蛋白分子在氧分压低的情况下容易聚合，形成杆状多聚体，致使红细胞由正常的圆盘状成为镰刀状，血液流动受到阻碍。,正常血红细胞,镰刀型血红细胞,分子病 这种由于遗传突变引起的蛋白质分子一级结构发生改变而产生的疾病称为分子病。,同源蛋白：不同生物中具有同一功能的蛋白质。它们的特点是其一级结构中，与功能直接相关的残基相同，而其它残基有差异，这些残基是可以改变的，这种变化往往与生物进化有关。例：Cytc与进化 生 物 残基改变数 生 物 残基改变数 生 物 残基改变数 黑猩猩 0 狗 11 狗鱼 23 恒河猴 1 骡 11 蛾 31 兔 9 马 12 小麦 35 袋鼠 10 鸡、火

12、鸡 13 面包霉 43 鲸 10 响尾蛇 14 酵母 44 牛、猪、羊 10 韧齿龟 15,2. 种属差异与分子进化,一定的结构，一定的功能,结构变化，功能变化,结构破坏，功能破坏,三、空间结构与功能的关系,第六节 蛋白质性质 一、两性解离与等电点：,概念：蛋白质净电荷等于零时的环境pH值。不同蛋白质其等电点不同：胃蛋白酶：1.02.5；胰岛素：5.35.35；血红蛋白：7.07；鱼精蛋白：12.012.4 特点：溶解度降低，可用于蛋白质的分离 电泳：大分子化合物在电场中运动的过程。 原理：不同蛋白的电荷正负和数量不同，分子量不同，形状不同，因此在电场中的运动速度不同。 方向与速度的鉴别：pI

13、 pH，正负为方向，数值为速度。 用途：分离鉴定蛋白质等大分子化合物,根据载体的不同，电泳有膜电泳、凝胶电泳等 如：人血清蛋白的醋酸纤维膜电泳图谱。,现有一混合蛋白质样品，内含A、B、C、D三种蛋白，其等电点分别为：A 10.8 B 7.5 C 5.6 D 3.2，指出在pH7.5的缓冲液中电泳时，它们各自的位置。 根据pI pH，结果为：A 10.8 7.5 = 3.3 B 7.5 7.5 = 0 C5.6 7.5 = 1.9 D 3.2 7.5 = 4.3 它们电泳后的位置为：,凝胶电泳,例题,蛋白质分子量小的几万，大的可达几百万，其大小为1100nm，已经达到胶体质点的范围，同时，蛋白质

14、分子外表为亲水表面，所以，蛋白质属于亲水胶体，并且是稳定的胶体。 稳定因素：水化膜，同种电荷,+,二、胶体性质,+,但是稳定是相对的，如果改变条件其稳定性就会发生变化，如加入有机溶剂则会脱去水化膜，改变p就会改变其电荷。,透析：大分子化合物不能通过半透膜的性，可用于蛋白质脱盐,沉降：在强离心场中，大分子化合物向离心力方向移动的现象,沉降系数（s）：单位离心场强单位时间内蛋白质的沉降距离，其单位是S（注意s与S的区别），如某蛋白的沉降系数为70，则表示为70S。 蛋白质S值的大小可以近似表示蛋白质分子量的相对大小。,三、变性：,概念：物理化学因素影响，空间结构破坏，性质改变，功能丧失,核糖核酸酶

15、的变性过程,因素：物理：热、高能射线，振动；化学：强酸、强碱、变性剂。 原因：空间结构破坏。 性质改变：溶解度下降，反应活性改变。 标志：生物活性丧失,盐析：高浓度中性盐使蛋白质沉淀的现象 原因：破坏了稳定胶体的两个因素,四、沉淀：,静电荷为零,优点：不影响蛋白质的空间结构，常用于蛋白质分离 常用的盐类：硫酸铵和氯化钠 盐溶：低浓度中性盐使蛋白质溶解度增加的现象 变性沉淀； 沉淀剂沉淀：有机溶剂、重金属盐、某些酸类，如苦味酸、三氯乙酸； 相互沉淀,280nm，由于有苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸,可用于蛋白质含量的测定 6.呈色反应：茚三酮反应 双缩脲反应：可用于蛋白质含量的测定（540nm）,5.紫外吸收：,一、蛋白质的提取的预处理 细胞的破碎，保持低温，控制