拓展视野　话说哺乳动物的性别控制.ppt

1、选修三 专题三 胚胎工程 拓展视野 哺乳动物胚胎的性别鉴定与控制,人教版 主讲人： 夏 丰 单 位：永城市高级中学,学习重点,1.哺乳动物胚胎性别鉴定与控制的意义 2.哺乳动物性控胚胎的生产原理 3.哺乳动物性别鉴定与控制的方法 4. 取样鉴定后胚胎的体外发育潜能研究,杜泊种公羊 荷兰黑白花奶牛 撒能奶山羊,1. 哺乳动物胚胎性别鉴定和控制的研究意义及进展,胚胎性别鉴定技术是胚胎工程技术的重要的组成部分。通过移植已知性别胚胎，可使家畜达到理想的性别比例，在畜牧业生产上具有重要的意义。对于畜群品种的改良、濒危物种的保种等显得非常重要。 19世纪末，法国科学家Cuenot就确立了遗传物质决定性别的

2、学说，真正行之有效的性别控制方法是在20世纪中期，直到目前，在生产中有实用价值的2种途径是受精前精子的分离（免疫学方法、流式细胞分类法 ）、受精后胚胎的性别鉴定（细胞学方法、免疫学方法、生物化学方法）。,2、性控胚胎的生产原理,决定哺乳动物性别的基因是Y染色体上的一个核心区基因，即SRY基因（Sex-determining region of the Y Chromosome ；Y染色体的性别决定区 ）。,2、性控胚胎的生产原理,X,X,X,Y,雌性性染色体,雄性性染色体,SRY 基因,精子决定性别,X,X,XX,X,Y,XY,3 胚胎性别鉴定的方法,受精前 精子 的分离 受精后胚胎的 性别鉴

3、定,物理法 免疫法 流式细胞分离法 细胞遗传学方法（核型分析法） 生物学的微量分析法（X-相关酶法） 免疫学方法 分子生物学方法（PCR 法）,3 受精后胚胎性别鉴定的方法,分子生物法 （PCR法）,1）常规PCR 2）巢式PCR（Nest-PCR） 3）ot start PCR,3 胚胎性别鉴定的方法3.1.精子的分离,精子分离法,物理法 免疫法 流式细胞分离法,3.1.1、流式细胞分离法,流式细胞分离法 它根据X、Y精子DNA含量的差异，借助特异性染色剂染色，然后根据发出荧光的强度测定DNA含量，来分离X、Y精子。,流式细胞分离示意图,3.1.1、流式细胞分离法,3.2 受精后早期胚胎性别

4、鉴定,哺乳动物早期胚胎性别鉴定PCR反应方法的建立及优选 哺乳动物早期胚胎取样鉴定后体外发育潜能研究 哺乳动物早期胚胎鉴定后胚胎移植效果的研究,3. 早期胚胎性别鉴定流程图,移植前胚胎,鉴定后发育潜能的研究,早期胚胎性别鉴定分子生物学方法（PCR 法）,常规PCR 巢式PCR（Nest-PCR） ot start PCR,思考讨论,聚合酶链式反应法（ PCR法）原理，原料，优点。,思考讨论,1聚合酶链式反应法（ PCR法）原理 以DNA双链复制的原理为依据，在模板DNA、引物和4种脱氧核糖核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的促合成作用，在体外合成DNA片段的方法。,思考讨论,聚合酶链式反应法

5、（ PCR法）优点 简便：与常规热启动酶反应条件一致，无需改变 PCR程序设置。 高效：有效减少了杂带及拖带产生，从而实现高特异性的PCR。 灵敏：可从0.05ng人基因组DNA模板中扩增出特定基因片段。,思考讨论,2.PCR法扩增目的基因的条件？ 原料（四种） 酶(Taq酶） 引物 缓冲液 模板,4.受精后胚胎性别鉴定的过程,4.1.试验材料 杜泊种公羊 杜泊羊供体 受体羊 杜泊种羊基地,试验仪器 显微操作仪 CO2培养箱凝胶成像系统,4.2.1胚胎的获取,子宫角冲胚 胚胎的获取,4.2.试验方法,体内胚胎的生产流程图,4.2.2.胚胎质量鉴定,表2-5胚胎质量鉴定,4.2.3胚胎的冷冻和解

6、冻,冷冻操作程序为： 胚胎管 程序冷冻仪 1/分的速度下降至-6 植冰（0.3/分） -35（10min） 液氮保存 解冻程序： 解冻温度为3538。解冻时将麦管从液氮中取出直接进入35的水浴5S，去除防冻剂。,4.2.4 PCR引物的合成与设计,表2-6 绵羊SRY基因和myogenin基因的引物序列,4.2.5 PCR反应模板的制备,杜泊羊血液基因组DNA的提取 血液和组织的DNA提取试剂盒（DNeasy Tissue kit ,QIAGEN）提取DNA 胚胎细胞的显微取样及DNA的提取 胚胎细胞的显微取样 取样细胞DNA的提取,吸 取 法,反复冻融法,4.2.6数据整理及分析,运用Exc

7、el对数据进行统计，再用SAS进行分析。,早期胚胎性别鉴定-扩增结果及分析示意图：,1 2 3 4 5,雄性特异性条带,内 标,早期胚胎性别鉴定-扩增结果及分析示意图：,1 2 3 4 5,1 ，4 雌性；2 ，3 ，5 雄性,雄性特异性条带,内 标,5.1杜泊羊早期胚胎性别PCR方法的建立及优选,5.1.1 24个细胞提取DNA PCR扩增结果,Hot start PCR方法扩增条带,常规PCR方法扩增条带,nest-PCR方法扩增条带,M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10,1 2 3 4 M 5 6 7 8 9 10,1 2 3 4 M 5 6 7 8 9 10,5.结 果,5.1

8、.2 68个细胞提取DNA PCR扩增结果,常规PCR方法扩增条带,nest-PCR方法扩增条带,Hot start PCR方法扩增条带,1 2 3 4 M 5 6 7 8 9 10,1 2 3 4 M 5 6 7 8 9 10,1 2 3 4 M 5 6 7 8 9 10,5.1.3 911个细胞提取DNA PCR扩增结果,常规PCR方法扩增条带,nest-PCR方法扩增条带,Hot start PCR方法扩增条带,1 2 3 4 M 5 6 7 8 9 10,1 2 3 4 M 5 6 7 8 9 10,1 2 3 4 M 5 6 7 8 9 10,5.2 杜泊羊取样鉴定后胚胎的体外发育潜

9、能研究,5.2.1鉴定鲜胚与未鉴定鲜胚体外发育潜能,表-鉴定鲜胚与未鉴定鲜胚体外发育潜能比较,5.2.2鉴定冻胚和未鉴定冻胚体外培养的发育潜能的比较,表3-2 鉴定冻胚和未鉴定冻胚体外培养的发育潜能的比较,5.2.3鉴定鲜胚冷冻和未鉴定冻胚体外培养的发育潜能的比较,表3-3鉴定鲜胚冷冻和未鉴定冻胚体外培养的发育潜能的比较,5.2.4 鉴定8-16细胞胚胎和鉴定桑椹胚的发育潜能,表3-4 鉴定 8-16细胞胚胎和鉴定桑椹胚发育潜能比较,5.3 杜泊羊取样鉴定后胚胎的体外发育潜能研究,解冻后胚胎,早期囊胚,扩张囊胚和孵化胚,5.4 杜泊羊取样鉴定后胚胎的体外发育潜能研究,鉴定后培养24h囊胚,培养

10、48h孵化胚,5.5 杜泊羊鉴定后胚胎移植效果的研究,5.5.1鉴定鲜胚和冻胚与未鉴定结果比较,鲜胚,冻胚,表3-7 鲜胚、冻胚移植结果,5.5.2鉴定冻胚胚胎移植结果,表3-5 受体情况及冻胚胚胎移植结果,5.5.3鉴定鲜胚胚胚胎移植结果,表3-6 鲜胚胚胎移植结果,6. 结 果,6.1胚胎的显微取样对胚胎发育能力的影响,从结果中可以看出常规PCR方法和nest-PCR方法对于取样10时，对胚胎造成的损伤较大，其移植妊娠率比取样个数 l0有明显下降。有人认为取样细胞数5时，鉴定效率会降低。因此，为了保证胚胎移植后的妊娠率，在完成性别鉴定条件下，取样细胞应越少越好，以减小对胚胎的损伤 。,6.

11、 结 果,6.2不同发育阶段的胚胎对胚胎发育潜能的影响 试验中所得鉴定后可移植胚胎均为发育至第七天的质量良好的致密桑椹胚和囊胚，但对经输卵管获得的816细胞的胚胎进行鉴定培养后发现，致密桑椹胚和囊胚阶段的鉴定胚胎发育潜能比816细胞的鉴定胚胎要好，由于羊胚胎一般在致密桑椹胚和囊胚移植，实验结果证实胚胎性别鉴定最好在此阶段进行鉴定。,6. 结 果,6.3 胚胎冷冻对鉴定后胚胎发育能力的影响 试验采用了程序化冷冻方法对未鉴定胚胎和鉴定胚胎进行冷冻，结果表明，鉴定冻胚的发育能力比鲜胚鉴定后冷冻胚胎的发育能力高。这可能与冷冻损伤和取样损伤有直接的关系。,通过对鲜胚和冻胚鉴定后胚胎进行移植发现，鉴定鲜胚的移植效果较好，冻胚的移植妊娠率为37.5%，比Herr等（1991）年对牛的27枚胚胎进行冷冻-解冻后移植妊娠率63%要低，与国内高建明等冻胚鉴定移植44.4%比较差异不显著。,小结,1.胚胎性别鉴定