蛋白质组学研究-----多肽阵列技术及其应用.ppt

1、蛋白质组学研究-,多 肽 阵 列 技 术,北京博肽健诺威生物技术有限公司 2011年11月,主 要 内 容,背景介绍 蛋白质组学 多肽阵列技术 多肽阵列技术应用,背 景 介 绍,生命科学回顾,1847 Schleiden和Schwann 细胞学说 1859 Darwin 物种起源进化论 1866 Mendel 孟德尔遗传定律 1870-80s Miesher 核酸物质核素 1910-1913 Morgen 基因理论基因连锁 1910 Kossel 分离出腺嘌呤、胸腺嘧啶和组氨酸 1940-50s Griffich和Avery 肺炎双球菌转化试验DNA是遗传物质 1953 Watson和Cric

2、k DNA双螺旋模型 1950s McClintock 跳跃基因 1954 Crick 中心法则 1960 Ochoa RNA聚合酶 Jacob 和Monod 乳糖操纵子模型 1966 Nirenberg 遗传密码,生命科学回顾,1966 Gellert DNA连接酶 1970 Smith 限制性内切酶 1970 Temin 逆转录酶 1972 Berg 首次DNA重组 1977 Sanger和Gilbert 首次DNA序列分析 1981 首次获得转基因动物（小鼠） 1983 首次获得转基因植物（烟草） 1984 人类基因组计划设想 1986 基因工程生物（GMO）首次环境释放 1989 美国

3、首次接受GMO的专利申请 1994 转基因西红柿作为商品面世 1997 克隆羊Dolly诞生 2001 人类基因组框架图完成 ,1995 流感嗜血杆菌1830 Kb,1997 酵母 12.7 Mb,1998 线虫9700 Kb,2002 水稻 430 Mb,2001 人 3 Gb,2000 果蝇 137 Mb,7,目前已经完成 测序的基因组: 1217 细菌(1013) 古生菌(80) 真核生物 (124),细菌(3984) 古生菌(202) 真核生物(1324),正在进行的：,( / Last Update: January 24, 20

4、10),功能基因组学,转录组学 蛋白质组学代谢组学 表型组学 相互作用组 ,8,基因组和蛋白质组,DNA,RNA,Proteins,Metabolites,Protein-DNA, Protein-RNA,Protein-protein,基因组,转录组,代谢组,蛋白质组,相互作用组,9,人类基因组计划完成之后，生物学被重新划分为前基因组和后基因组两部分。 科学研究已开始进入“后基因组时代”。 有科学家形象地说道：即使基因测序全部完成，也只好像是一本没有姓名、只有号码的电话簿。“后基因组时代”的最终目标，是要把深奥的DNA语言变成一本基因大百科全书。 蛋白质组学是后基因组学时代研究的中心，而以阐

5、明生物体内蛋白质表达模式与功能模式为目标的蛋白质组学成为功能基因组学研究的重要内容之一。,蛋 白 质 组 学,蛋白质组（proteome）：PROTEins + genOME，意思是Proteins expressed by a genome（基因组表达的所有蛋白质）。 最早是由澳大利亚学者Wilkins和Williams等人于1994年提出，并首次公开发表在1995年7月的Electrophoresis杂志上(有关一种已知最小的、能独立自我复制的原核生物-支原体的蛋白质组分析结果)，指的是由一个细胞、一个组织或是一种生物的基因组所表达的全部相应的蛋白质。,概念,蛋白质组学(proteomic

6、s) ：指应用各种技术手段来研究蛋白质组的一门新兴科学，其目的是从整体的角度分析细胞内动态变化的蛋白质组成成份、表达水平与修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用与联系，揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律。 蛋白质组学可以被广泛定义为生物样本中蛋白质的系统分析与存档，其目的在于归类细胞中的蛋白质的整体分布，鉴定并分析感兴趣的个别蛋白，最终阐明它们的关系与功能。,蛋白质组与基因组相对应，也是一个整体的概念，是基因组表达的全部蛋白。但两者又有根本的不同之处。 （1）基因组是静态的，一个有机体从它的发生、 发展到衰老、死亡，不同细胞、组织和器官的基因组是基本稳定不变的 。 （2）蛋白质组作为基因组表达的产物

7、随时间、地点、环境等条件变化，是一个动态的概念。,蛋白质组研究的必要性,从mRNA 表达水平并不能预测蛋白表达水平 用基因表达连续分析法研究对数生长期啤酒酵母的80 个基因,结果没有发现翻译和转录丰度有明显相关; 对某些基因,相同的mRNA 丰度翻译成蛋白的量的差异可达50 倍;而相等的蛋白量可由丰度相差40 倍的mRNA 录而来。,蛋白质的动态修饰和加工并非必须来自基因 蛋白质在翻译后可有多种调节方式,如糖基化、磷酸化、异戊二烯化、酰化作用等。,蛋白质组动态地反映生物系统所处的状态 细胞周期的特定时期、分化的不同阶段、对应的生长和营养状况、温度、应激和病理状态等其相应的蛋白质组之间存在差异。

8、 对其中蛋白质合成、降解、加工、修饰的调控过程, 只有通过蛋白质的直接分析才能提示。,蛋白质组学的研究意义,直接阐明生命在生理或病理条件下的变化机制， 提供几乎所有的生理和病理过程或结果的重要 信息。 蛋白质组学的研究手段也可以应用于农业研究、 环境保护等多方面。 蛋白质组研究不仅可实现与基因组的对接与确 认，直接揭示生命活动规律和本质、人类重大 疾患（病原体）致病的物质基础以及发生与发 展的病理机制； 广泛推动生命科学基础学科以及分析、信息、 材料等应用科学的发展； 对促进生物医药产业乃至国民经济的发展具有 重大的战略意义。,蛋白质组学的研究内容,在蛋白质水平上定量、动态、整体地研究生物体，

9、它旨在阐明生物体全部蛋白质的表达模式及功能模式。 组成（表达）蛋白质组学 蛋白质表达谱（组织、器官、细胞、亚细胞分布等） 比较蛋白质组学 比较不同蛋白质组的差异与相似性； 结构蛋白质组学 蛋白质三维结构的解析(X-ray/NMR/modelling)； 功能蛋白质组学 蛋白质的功能和相互作用； 蛋白质组学研究的技术平台与生物信息学 分离、鉴定技术，分析软件和数据库。,蛋白质组学的研究技术,蛋白质分离技术 凝胶双向电泳、HPLC； 蛋白质鉴定技术 Edman 测序、质谱技术； 图像分析与生物信息 图像分析软件，数据库； 相互作用研究技术 酵母双杂交技术、免疫共沉淀、蛋白质芯片等。,蛋白质组学研究

10、发展,1996年澳大利亚建立了世界上第一个蛋白质组研究 中心（Australia Proteome Analysis Facility，APAF） NCI和FDA共同投资数百万美元建立癌症不同阶段的蛋白质组数据库。 英国建立三个蛋白质组研究中心对已完成或即将完成全基因组测序的生物体进行蛋白质组研究。 Celera公司投资上亿美元独自启动了全面鉴定和分类汇总人类组织、细胞和体液中的蛋白质及其异构体，构建新一代的蛋白质表达数据库的工作。 国际人类蛋白质组组织（HUPO)于2001年2月9日宣告成立。,我国于1998年启动了蛋白质组学研究，在中科院上海生物化学研究所举办了两次全国性的蛋白质组学研讨会

11、。 2003成立了中国人类蛋白质组组织（CHHUPO），并分别于2003年9月、2004年8月以及2005年8月召开了中国蛋白质组学首届、第二届及第三届学术大会，2004年10月在中国北京召开了第三届国际蛋白质组学会议。 科技部已将疾病蛋白质组研究列入我国“973”计划项目和“863”计划项目；国家自然科学基金委员会也将“蛋白质组研究”列为重点项目。 我国在鼻咽癌、白血病、肝癌和肺癌蛋白质组研究方面取得了较大的进展。,多 肽 阵 列 技 术,功能蛋白组学,功能蛋白质组学是指对蛋白质间、蛋白质与DNA/RNA 间的相互作用的研究。以细胞内与某个功能有关或某种条件下的一群蛋白质为主要研究内容， 由

12、此建立细胞内外信号传递的复杂网络。,蛋白质相互作用研究方法,酵母双杂交系统 免疫共沉淀技术 Pull Down Assay 串联亲和纯化技术（TAP） 多肽阵列技术,多肽阵列技术,多肽阵列合成,多肽阵列应用设计,Overlapping Pep-Array Pep-Hit Pep-Replace,Overlapping Pep-Array,-EAPRRRSPSPTPTPGPSRRGPSLGASSHQHSRRRQGWLKEIRKLQKST- 1EAPRRRSPSP 11PSLGASSHQH 2PRRRSPSPTP 12LGASSHQHSR 3RRSPSPTPTP 13ASSHQHSRRR 4SPS

13、PTPTPGP 14SHQHSRRRQG 5SPTPTPGPSR 15QHSRRRQGWL 6TPTPGPSRRG 16SRRRQGWLKE 7TPGPSRRGPS 17RRQGWLKEIR 8GPSRRGPSLG 18QGWLKEIRKL 9SRRGPSLGAS 19WLKEIRKLQK 10RGPSLGASSH 20KEIRKLQKST,Pep-Replace,通过替换多肽中的氨基酸残基的方式，进行突变研究。 确定在蛋白相互作用中关键氨基酸残基。,Pep-Hit / TIMEA,多肽设计法则 Complementary Hydropathy Site Chain Interference

14、/ Steric Hindrance -Carbon Approach / Backbone Alignment Charge Transfer Capacity,多肽阵列技术的应用,蛋白组学研究 蛋白-蛋白相互作用的研究 作用于靶蛋白的药物设计 大通量的药物筛选研发 快速研制高度特异性的疫苗及诊断试剂,多肽阵列技术的主要特点和优势,高密度、高通量：可同时测定上万个蛋白-多肽生化反应。 高特异性：深层揭示蛋白结合机制，准确定位抗体特异表位和蛋白结合区域。 成本低、周期短、操作简单：基于化学合成的多肽阵列芯片成本为基于生物培养的抗体芯片、全蛋白芯片的数百分之一。 准确可靠：纯度稳定、结果明确、直

15、观、易分析。,北京博肽健諾威生物技術公司 GenoVax Biotech. Inc.,专业设计和合成多肽阵列芯片用于： 蛋白质相互作用研究 药物筛选 诊断试剂 各种生物和生物标记物的检测,Pep-Overlap,抗原表位定位 疫苗效应的免疫检 测相互作用蛋白的 结合域定位 受体-配体相互作用 中结合基序的发现 蛋白质与其它生物 大分子结合基序发现 血清生物标记物筛查,Pep-Scan,低投入、高通量 多肽浓度每点大于50nm, 纯度大于70% 多肽中关键氨基酸残基 的快速筛查 适用于给定多肽的氨基 酸组合快速筛查 发现或优化多肽,Pep-Optima,高通量、低投入 多肽浓度大于50nmol每

16、点，多肽纯度大于70% 用于给定多肽的氨基酸组合的快速筛查 酶底物、多肽候选药物等肽片段的优化 发现及优化多肽,Pep-Hit,最长20个氨基酸残基多肽 最多产生约1000个候选物 高成功率：5-20。 低价高效，适用于多肽药物研究开发，以及抑制剂和激活剂的发现,Pep-Phos,利用已知底物，确定激酶或磷酸化酶及其底物分析 不同激酶或磷酸化酶间底物特异性上的指纹图谱差别 激酶或磷酸化酶抑制剂评价 定位蛋白质磷酸化位点 阐明信号转导通路,Pep-Lyse,孤酶底物确定，发现未知蛋白酶及酶底物 确定蛋白质的蛋白酶解位点，优化已知酶底物 不同蛋白酶间底物特异性上的指纹图谱差异 污染酶的活性检测,健

17、諾威技術的突出优势,高速阵列膜合成：采用自控机器人逐层氨基酸点膜技术，比多肽逐点点膜技术速度提高几十倍。 介质-多肽分子“立式”固定：与多数其他多肽芯片合成采用的“卧式”分子固定方式相比，更接近于生物液相反应环境。 庞大的表位样本库和多肽分子样本库（HELP筛选系统）：运用多种包含有成千上万个不同结构的多肽分子的多肽分子库，其中包括用于免疫反应的抗原-抗体表位样本库，与各种细胞内信号传递相关的多肽库以及和多种疾病和生化反应机制相关的多肽分子样本库，可高成功率地筛选出能够与特定的蛋白靶点结合的多肽。 积30多年蛋白-多肽生化反应数据和经验积累而研制开发的多肽分子设计系统：主持研究的科学家具有超过

18、30年的研究经验，并开发出可以按照蛋白分子序列和多级结构，将蛋白-多肽分子相互亲和性、稳定性准确量化的综合算法。该系统，已多次成功地用于设计和筛选能够与蛋白靶点有效结合的多肽。,多肽阵列技术应用,表位筛查,Peptide Array for Pathogen Proteome,Patient Serum,Hot Spots / Epitopes,In-Vivo or In-Vitro Tests,蛋白质结合位点的发现,Target Protein,Protein Probe (Bait Protein),多肽药物的设计及开发,Reaction,Target Protein,Cell,SARS

19、病毒抗原表位筛查,ORF 1a ORF 3 3. ORF 4,4. S protein 5. ORF 7 6. ORF 8,7. ORF 9 8. ORF 10 9. ORF 1b,10. ORF 11 11. N protein 12. E,13. M protein 14. ORF 13 15. ORF 14,SARS 抗原表位确定,Acute,Convalescent,Acute,Convalescent,Deceased,Tau 蛋白抑制多肽发现,Tau蛋白结合位点发现,Tau-Tubulin Binding,Tau-Tau Binding,筛选出来的多肽抑制Tau蛋白的结合,Tau-Tubulin Bind