发酵技术第二章.ppt

1、第一章 绪论,发酵与发酵技术的定义 发酵产物的类型 发酵工业的特点与范围,发酵 1.来源-酵母作用产生气泡（酒的生产） 2.狭义-生化意义 指在无氧条件下一个有机化合物能同时作为电子供体和最终电子受体并产生能量的过程。 3.广义-工业发酵 利用微生物在有氧或无氧条件下的生命活动来制造产品的过程。,定义,发酵技术 指以微生物为主要操作对象的生物工程技术。 eg:基因工程技术在发酵工程上的应用,定义,微生物菌体,传统菌体发酵工业 现代菌体发酵工业,酵母发酵,菌体蛋白（单细胞蛋白）发酵,杀虫剂：苏云金杆菌，蜡样芽孢杆菌，侧孢芽孢杆菌；白僵菌、绿僵菌,疫苗,新的菌体发酵产品: 药用功能菌体 茯苓菌茯苓

2、 担子真菌灵芝、香菇类 虫草头孢菌 密环菌,微生物菌体,面包酵母,藻类,芽孢杆菌和伴孢晶体,虫草头孢菌发酵生产虫草,发酵产物的类型,初级代谢产物 初级代谢：能使营养物质转换成细胞结构物质，维持微生物正常生命活动的生理活性物质或能量的代谢。 初级代谢产物：微生物通过代谢活动所产生的，自身生长和繁殖所必需的物质。 特征： 不同的微生物初级代谢产物基本相同； 初级代谢产物合成过程是连续不断的。,次级代谢产物 次级代谢：指某些微生物进行的非细胞结构物质和维持其正常生命活动的非必须物质的代谢 次级代谢产物：微生物生长到一定阶段才产生的化学结构十分复杂、对该微生物无明显生理功能，或并非是微生物生长和繁殖所

3、必需的物质。 特征： 不同的微生物次级代谢产物不同； 作用因种类不同而异,酶制剂,广泛用于医药工业、食品和轻工业、石油化工 酶试剂盒：医用诊断试剂盒、工业分析试剂盒等 药用酶制剂：胆固醇氧化酶，葡萄糖氧化酶等 食品工业用酶制剂：果胶酶，淀粉酶等 基因重组技术用酶制剂：核酸酶（nuclease），包括DNA、RNA的内切酶、外切酶，DNA限制性内切酶、DNA连接酶等。 饲料酶制剂：木聚糖酶、-葡聚糖酶、纤维素酶等,微生物转化产物 通过微生物细胞将一个化合物转变成另一个结构相关，更具经济价值的化合物。,发酵产物的类型,发酵工业的特点与范围,发酵工业的特点 门类众多 技术发展迅速 节约资源，有益环境

4、 生产过程独特,发酵工业的范围 酿酒 食品 有机溶剂发酵 有机酸发酵 抗生素工业 酶制剂 氨基酸 核苷酸类物质 维生素 生理活性物质 微生物菌体蛋白发酵 微生物环境净化 生物能工业 微生物冶金工业,第二章 工业微生物菌种的选育、保藏与培养,在微生物工业应用中，微生物菌种工作主要包括 菌种的分离筛选：挑选符合生产要求的菌种，这是选种工作的任务。 菌种培育：改良已有菌种的生产性能，使产品的质和量不断提高,或使它更适应于工艺的要求,这是育种工作的任务。 菌种的保藏： 一切生产菌种都要使它避免死亡和生产性能的下降，这是菌种保藏工作的任务。 退化菌种的复壮： 如果发现菌种的生产性能下降，就要设法使它恢复

5、，这是菌种复壮工作的任务。,细菌（bacteria）：常用的有枯草芽孢杆菌、醋酸杆菌、棒状杆菌、短杆菌等。 酵母菌（yeast）：属单细胞真核生物，主要分布于含糖较多的酸性环境中。常用的有：啤酒酵母属、假丝酵母属、类酵母等。,啤酒酵母,棒状杆菌,短杆菌 棒状杆菌,yeasts,工业生产常用的微生物,第一节 工业微生物常用菌种,第二节 工业微生物常用菌种,霉菌（mould）：喜偏酸性环境。可用于生产多种酶制剂、抗生素、有机酸及甾体激素等。 放线菌（actionmycetes）：原核微生物类群。在含有机质丰富的微碱性土壤中分布较为广泛。主要用于生产多种抗生素。,放线菌,霉菌,微生物工业对菌种的要求

6、,原料廉价、生长迅速、目的产物产量高。 易于控制、酶活性高、发酵周期较短。 抗杂菌和噬菌体能力强。 菌种遗传性能稳定，不易变异和退化，不产生任何有害的生物活性物质和毒素。,工业微生物菌种的获得途径 从微生物菌种保藏机构购买菌种 从自然界或现有菌种中分离筛选菌种 对筛选出的菌种进行改良从而获得新种,第二节 工业微生物菌种的选育,国内：中国工业微生物菌种保藏管理中心CICC 中国科学院典型培养物保藏委员会,一、微生物菌种保藏机构,采 样,增殖培养,纯种分离,纯培养,生产性能测定,方法、地点、时间和周围环境记录,纯种分离就是获得单个菌落： 1稀释分离法 2平板划线分离法 涂菌： 划线分离 3组织分离

7、法,测定代谢产物或其它目的性状,二、从自然界或现有菌种中分离筛选菌种,采样 采样地点 森林枯枝落叶、朽木-产纤维素酶的菌种 油田附近土壤-石油酵母 污染土壤-甲烷产生菌 果园、菜园等富含碳水化合物的土壤和沼泽土 -酵母菌、霉菌 菜园土、沼泽土（耕作过的） -细菌、放线菌 淀粉加工厂、糕点厂、酒厂 -淀粉酶、糖化酶产生菌,采样时间 雨水少、温度适中的秋初 采样 无菌刮铲、土样采集器等采集有代表性的样品，取离地面50-150mm处的土，装入牛皮纸袋或玻璃瓶中，贴上标签（样品种类、采集日期、地点、地理、生态参数）,2.增殖培养 控制培养基中碳源种类 添加某些抑制因子或促进因子 控制培养条件,3.纯种

8、分离及纯培养 稀释分离法 划线分离法 组织分离法,挑取菌落,用木制接种棒挑取分离良好的单菌落,4.生产性能测定 野生型菌株采用与生产相近的培养基和培养条件，通过三角瓶进行小型发酵试验。 结果有两种可能： 获得适于工业发酵菌株 只获得选育所需的出发菌株,几种选育方法,自然选育 诱变育种 杂交育种 分子育种,经验育种,定向育种,主要通过突变和筛选来获得优良菌株,主要通过DNA重组来获得优良菌株,三、微生物菌种的自然选育,自然选育 在生产过程中，不经过人工处理，利用菌种的自发突变而进行菌种筛选的过程叫做自然选育。 菌种的自然突变往往有两种可能性:菌种衰退,生产性能下降;代谢更加旺盛，生产性能提高。,

9、四、微生物菌种的诱变选育,（一）诱变育种的一般步骤 用人工的方法处理微生物，使他们发生突变，再从中筛选出符合要求的突变菌株，供生产和科学实验用。 出发菌株选择、诱变处理、筛选突变株,1、出发菌株的选择 自然界直接分离到的野生型菌株 经历过生产条件考验的菌株 已经历多次育种处理的菌株 2.同步培养 3.制备单细胞或单孢子菌悬液,4、诱变处理 常用的诱变剂主要有紫外线、硫酸二乙酯，NTG、NMU 根据诱变剂用量对菌体致死率的曲线选择合适的处理剂量。 一般突变率随诱变剂量的增大而增高，但达到一定剂量后，突变率会下降。,5.筛选变异菌株 初筛：从分离得到的大量微生物中，将目标微生物筛选出来的过程。 一

10、般采用平板筛选,复筛：在初筛的基础上，进一步鉴定有希望菌株的 生产能力强弱的过程。 复筛采用摇瓶培养后，发酵液采用精确的分析方法进行测定。,（二）营养缺陷型突变菌株的筛选,1.术语 营养缺陷型 野生型 原养型 基本培养基 补充培养基 完全培养基,2营养缺陷型菌株筛选的一般方法 （1）诱变剂处理 （2）淘汰野生型菌株 抗生素法（细菌用青霉素法 ，酵母菌用制霉素法） 菌丝过滤法（真菌和放线菌等丝状菌的野生型孢子在基本培养基中能萌发长成菌丝，而营养缺陷型的孢子则不能萌发）,（二）营养缺陷型突变体的筛选,夹层培养法,限量补充培养,影印接种法,逐个检出法,（3）检出营养缺陷型,影印法,（4）鉴定营养缺陷

11、型, 含营养缺陷型菌株的基本培养基平板的制备 营养缺陷型营养类别的鉴定（氨基酸、维生素、碱基） 缺陷型菌株单一营养因素的鉴定。,第三节 工业微生物菌种的保藏,理想的菌种保藏方法应具备的条件 (1) 经长期保藏后菌种存活健在； (2)保证高产突变株不改变表型和基因型，特别是不改变初级代谢产物和次级代谢产物生产的高产能力。 (3)菌种保藏的基本措施是低温、干燥、真空。,一、菌种保藏原理,保藏目的：提高存活率、减少变异、尽量保持优良性能,原理 DNA复制时自发突变导致菌种退化，因此要创造代谢不活泼的状态。 休眠态（孢子、芽孢) 代谢不活泼的状态 环境（干燥、低温、缺氧、缺营养）,二、菌种保藏的方法,

12、斜面低温保藏法 液体石蜡覆盖保藏法 液氮超低温保藏法 沙土管保藏法 冷冻干燥保藏法,1、斜面低温保藏法(传代保藏) 保藏方法：将菌种定期在新鲜琼脂斜面基本培养基上传代，4左右保藏 保藏期限： 一般16月 优点：方法简单、存活率高，具有一定的保藏效果。 缺点：菌种仍有一定的强度的代谢活动条件，保存时间不长，传代多，菌种容易变异及退化。 适用菌种：细菌、酵母、防线菌、霉菌,2、液体石蜡覆盖保藏法 保藏方法：将生长好的斜面在无菌条件下倒入已灭菌的液体石蜡，油层高于斜面末端1cm，然后直立放于冰箱中保存。 保藏期限：一般为110年 注意事项：对菌株应预先作石蜡培养试验，保藏株23年也应做一次存活试验。

13、此方法简便有效，可用于霉菌、酵母、放线菌和好氧细菌的保藏,3、液氮超低温保藏法 保藏方法：用冷冻保护剂制备菌悬液，混匀，取0.5lml分装玻璃安瓿管，酒精喷灯封口；以1-2/min快速冷冻至细胞冻结点(-35左右)，迅速移入液氮罐中于液相(-196)或气相(-156)中保存 保藏期限：一般可达10年以上 复苏方法：从液氮罐中取出后立即将安瓿管置于38-40水浴中，急速溶解后，开启安瓿接种培养 注意事项：保护剂最终浓度为10(甘油)或5(二甲亚砜)；甘油为高压蒸汽灭菌，二甲亚砜最好为过滤灭菌；适用于各种微生物。,安瓿管,4、沙土管保藏法 保藏方法：制备沙土管斜面培养菌悬液移入沙土管干燥后熔封低温

14、保藏 保藏期限：因菌种而异，一般可达10年以上 注意事项：方法简单，保藏时间较长，复活方便；适用于产孢子的微生物(霉菌和放线菌)及细菌的芽孢,5、冷冻干燥保藏法,5、冷冻干燥保藏法 保藏期限： 10年以上 注意事项：冷冻干燥过程中必须使用冷冻保护剂，如脱脂乳和蔗糖；忌猛烈开启；冻干后的菌株无需进行冷冻保藏，便于运输销售，应用广泛,6、普通冷冻保藏法 保藏方法：将菌悬液或斜面培养物细胞加入菌种保护剂，密封于试管或EP管内，贮藏于冰箱的冷藏室或普通冰箱(-20)中 保藏期限： 一般12年 注意事项：经过解冻的菌株不宜二次保藏；保藏过程中应注意控制保藏温度，培养瓶或试管应严格密封；不适宜微生物的长期

15、保藏,二、菌种的退化与复壮,（一）常见的菌种退化现象 退化的表现： 菌落和细胞形态的改变，苏云金芽孢杆菌伴孢晶体小而少 生长速度缓慢，孢子数量减少 代谢产物生产能力下降，对寄主寄生能力下降 （二）菌种退化的原因 菌种退化的主要原因是有关基因的负突变。,二、菌种的退化与复壮,（三）防止菌种退化的措施 1控制传代次数 2创造良好的培养条件 3利用不同类型的细胞进行移种传代 4采用有效的菌种保藏方法,（四）退化菌种的复壮 复壮：弱毒菌种在敏感动物或细胞上多次传代，达到毒力增强的目的（日本731部队用人试验，目的是增强细菌毒力，做细菌武器使用） 措施 1.纯种分离：稀释平板法，平板划线分离或涂布法 2.通过寄主进行复壮：寄生性微生物的退化菌株可通过接种至相应昆虫或动植物寄主体内以提高菌株毒性。 3.联合复壮：高剂量紫外辐射+低剂量DTG