基因诊断1.ppt

1、基 因 诊 断,中南大学 湘雅二院 王新,长期以来，单基因遗传病的诊断主要靠临床观察和系列化学检查，但生化学检查要求有相应基因表达产物的体液或细胞，并对基因产物或代谢异常机理有所了解，但对绝大多数遗传病而言，目前还远未达到这种认识。,理想的诊断方法是对患者基因或DNA本身直接进行分析，因为这种分析摆脱了上述各种限制。 机体各种组织的核细胞均有全套基因组DNA，都可以作为分析的材料，而不必考虑表达问题。如苯酮尿症时缺乏的苯丙氨酸羟花酶只在肝中产生，但任何组织、细胞的DNA均可用作苯丙氨酸羟化酶基因的检查。,第一节 基因的概念,所谓基因是带有遗传性状的DNA片段，每个基因具有自身的遗传密码。基因虽

2、然只有小小的一段，却有着重要的功能。简单地说：基因决定蛋白质，蛋白质决定代谢作用，代谢作用决定各种性状。,1. 基因的分类： 结构基因： 具有编码RNA的功能，指导 合成各种具有生物学功能的肽链，其 DNA含量在基因组中10。 非结构基因：广泛分布在基因组各处。 如假基因，结构与结构基因相似，但 无结构基因的生物学功能。,2 基因的结构 无论基因的大小，基本结构都一样，包括： 启动子 增强子 外显子 内含子 终止子,基因诊断就是在基因的水平作出诊断 旨在对患者或受检者的某个特定基因(DNA)或基因转录物(RNA)进行分析和检测，从而对相应的疾病进行诊断。,基因诊断的优势 准确、早期、所需标本量

3、少 基因诊断的使用限制 疾病与特定疾病基因的关系大多不明确；许多疾病存在遗传异质性；绝大多 数多发病和常见病多是多基因病。,第二节 基因诊断的原理,核酸分子杂交是基因诊断的最基本的方法之一。 它的基本原理是：互补的DNA单链能够在一定条件下结合成双链，即能够进行杂交。 这种结合是特异的，即严格按照碱基互补的原则进行，它不仅能在DNA和DNA之间进行，也能在DNA和RNA之间进行。,第二节 基因诊断的原理,因此，当用一段已知基因的核酸序列作出探针，与变性后的单链基因组DNA接触时，如果两者的碱基完全配对，它们即互补地结合成双链，从而表明被测基因组DNA中含有已知的基因序列。,第二节 基因诊断的原

4、理,由此可见，进行基因检测有两个必要 条件， 1特异的DNA探针 2. 模版DNA（基因组DNA） 当两者都变性呈单链状态时，就能进 行分子杂交。,第三节 常用基因诊断技术,一、限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymporphism, RFLP） 1RFLP:由于碱基的变异可能导致酶切点的消失或新的切点出现，从而引起不同个体在用同一限制酶切时，DNA片段长度出现差异，这种由于内切酶切点变化所导致的DNA片段长度的差异，称为RFLP 。,第三节 常用基因诊断技术,RFLP反映了常见的个体间DNA核苷酸的可遗传性变异，它按照孟德尔方式遗传。RFLP

5、可用Southern印迹杂交法检出。用Southern杂交检出RFLP时，如探针跨越切点，则被切开的两个片段均可与探针杂交，从而显示两条杂交带。,第三节 常用基因诊断技术,二、聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR） 应用PCR技术可以使特定的基因或DNA片段在短短的23小时内体外扩增数十万至百万倍。扩增的片段可以直接通过电泳观察，也可用于进一步的分析。这样，原先需要一、二周才能作出的诊断可以缩短至数小时。,第三节 常用基因诊断技术,三、扩增片段长度多态性（amplified fragment length polymorphism,Amp-FLP） 小卫

6、星DNA和微卫星DNA的长度多态性可以通过PCR扩增后电泳来检出，并用于致病基因的连锁分析，这种诊断方法称为Amp-FLP。 PCR扩增后，产物即等位片段之间的差别有时只有几个核苷酸，故需用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离鉴定。此法多用于突变性质不明的连锁分析.,第三节 常用基因诊断技术,四、等位基因的特异寡核苷酸探针诊断法 当基因的突变部位和性质已完全明了时，可以合成等位基因特异性寡核苷酸探针（allele-specific oligonucleotide,ASO）用同位素或非同位素标记进行诊断。 探针通常为长20bp左右的核苷酸。,第三节 常用基因诊断技术,用于探测点突变时一般需要合成两种探针： 一

7、种与正常基因序列完全一致，能与之稳定地杂交，但不能与突变基因序列杂交； 另一种与突变基因序列一致，能与突变基因序列稳定杂交，但不能与正常基因序列稳定杂交，这样，就可以把只有一个碱基发生了突变的基因区别开来。,第三节 常用基因诊断技术,PCR可结合ASO，即PCRASO技术。即先将含有突变点的基因有关片段进行体外扩增，然后再与ASO探针作点杂交，这样大大简化了方法，节约了时间，而且只要极少量的基因组DNA就可进行。,五、单链构象多态性（signle strand conformation polymorphism, SSCP） SSCP是指单链DNA由于碱基序列的不同可引起构象差异，这种差异将造

8、成相同或相近长度的单链DNA电泳迁移率不同，从而可用于DNA中单个碱基的替代、微小缺失的检测。,第三节 常用基因诊断技术,第三节 常用基因诊断技术,用SSCP法检查基因突变时，通常在疑有突变的DNA片段附近设计一对引物进行PCR扩增，然后将扩增物用甲酰胺等变性，并在聚丙烯酰胺凝胶中电泳，突变所引起的DNA构象差异将表现为电泳带位置的差异，从而可据之作出诊断。,第三节 常用基因诊断技术回顾,一、限制性片段长度多态性 - RFLP 二、聚合酶链反应 - PCR 三、扩增片段长度多态性 - Amp-FLP 四、等位基因特异寡核苷酸探针 - ASO 五、单链构象多态性诊断法 - SSCP,第四节常见遗

9、传性疾病的发生,由于基因的DNA分子结构异常所导致的疾病有以下几种： 1. 点突变 终止密码子突变 移码突变 密码子缺失和插入 融合基因,1. 点突变：由于DNA分子的碱基转换或颠换造成单个碱基替代，导致三联体遗传密码改变，使得相应表达翻译的肽链中氨基酸发生改变而导致蛋白质结构改变，最终引起该蛋白的生理功能发生改变。 GGTACT GGTGCT 转换 GGTTCT 颠换 AACGTC AACATC AACCTC 在目前发现的血红蛋白异常中，绝大多数属于这种点突变类型。, 终止密码子突变： mRNA翻译蛋白质的终止密码有UAA、UAG、UGA。当终止密码子发生点突变，如UAA转换为CAA时，终止

10、密码翻译为谷胺酰胺，肽链无法终止导致肽链延长。相反，肽链中途某一密码突变终止密码时，肽链就提前终止变短。 如在珠蛋白基因突变中，转录mRNA密码子17由AAGUAG，使翻译的珠蛋白过早终止，造成链过短，而无正常功能，导致珠蛋白生成障碍性贫血发生。, 移码突变： 由于DNA分子三联体密码子之间是无标点符号的，因此当DNA的碱基序列中缺失或插入一个核苷酸，就相当于多了或少了一个碱基，使得在突变位置以后的三联体密码子均依次发生变化，包括终止密码。 GGT ACT GGC AGC T 插入 GGT CT 缺失 AAC GTC AAT GAT C AAC TC,移码突变可以是肽链的氨基酸发生改变，也可是

11、肽链长短发生改变。而且这种突变位置越靠近翻译起始端（5端）其后果越严重。 如珠蛋白基因转录的密码子41-42产生缺失，造成链合成提前终止，这种链不稳定而导致珠蛋白生成障碍性贫血发生。, 密码子缺失和插入： 它与移码突变不同的是生殖细胞在减数分裂时，染色单体发生错配或不等交换，造成在基因DNA分子中，缺失或插入的核苷酸不是一个，而是一部分，即多了或少了一部分密码子。当然其肽链也相应缺失或插入一个以上的氨基酸。 GGT ACT GGT TCA ACG CCT AAC GTC AAC CTG GTA CTC, 融合基因： 由于减数分裂时不同蛋白肽链的基因之间发生不等交换，结果造成某一蛋白基因同时融合

12、两种不同蛋白基因的部分碱基，由此合成的肽链也含有两种不同蛋白的氨基酸序列。,第五节 遗传病的基因诊断选择,根据遗传物质改变的类型、大小、部位、作用以及时间，遗传性疾病大致可分为： 1.染色体病 2.单基因病 3.多基因病 4.线粒体病 5.体细胞遗传病,遗传病的类型和发病率类型 出生时 成年后 终身发 发病率 发病率 病风险染色体病 1.8 2 3.8 单基因病 3.6 16.4 20 多基因病 46.4 600 646.4 体细胞遗传病 240 240 ,1.常染色体显性遗传性疾病 2.常染色体隐性遗传性疾病 3.X连锁显性遗传性疾病 4.X连锁隐性遗传性疾病 5.Y染色体连锁遗传性疾病,一

13、、单基因病的分类,1 2,3 4,2 4,? ?,*选择与疾病基因有紧密连锁关系的遗传标记 (CA)n标记给每条染色体打上印记，然后判断待诊 者所拥有的染色体是否正常,1.常染色体显性遗传性疾病的基因诊断 判断待诊者（胎儿）是否从先证者（亲代）得到异常染色体（一条）或疾病基因（一个）是否存在致病突变 诊断方法 突变分析和连锁分析,1 2,3 4,2 4,2 3,4 6,2 3,1 4,3 5,4 6,1345,1446,24 36,3 4,5 6,3 6,2335,2. 常染色体隐性遗传性疾病的基因诊断 判断待诊者（胎儿）是否从先证者（亲代）得到异常染色体（二条）或疾病基因（二个）是否存在致病

14、突变 诊断方法 突变分析和连锁分析,1 2,3 4,2 4,2 3,4 6,2 3,1 4,3 5,4 6,1345,1446,24 36,3 4,5 6,3 6,2335,3. X连锁隐性遗传性疾病 判断待诊者（胎儿）是否从携带者（母 亲）得到异常染色体（一条）或疾病基 因（一个）是否存在致病突变 诊断方法 突变分析和连锁分析,1 2,3 4,2,1,4,3,？,杂合子,突变半合子,正常半合子,突变纯合子,正常纯合子,4. X连锁显性遗传性疾病 判断待诊者（胎儿）是否从先证者（父亲或母亲）得到异常染色体（一条）或疾病基因（一个）是否存在致病突变 诊断方法 突变分析和连锁分析,1 2,3 4,

15、2,1,4,3,？,5. Y连锁显性遗传性疾病 判断胎儿是否从父亲得到Y染色体或疾病基因是否存在致病突变 诊断方法 突变分析,？,基因诊断方法分两类： 1.直接诊断 2.间接诊断,目的：明确受检者的特定基因是否存在缺陷； 条件：明确某一基因为某种疾病的疾病基因， 已知那些突变为致病突变 标本：血标本或其他组织标本（包括石蜡切片） 家系资料及标本：不需 遗传异质性的影响：不大 DNA重组的影响：无,1.直接诊断突变分析 （鉴定是否存在致病突变）,突变分析的最常用方法,1. PCRSSCP 2. PCRRLFP 3. 直接测序,2.间接诊断连锁分析 （染色体单体型分析）,目的：明确受检者否存从亲代

16、遗传到带有致病 的基因 条件：明确疾病基因的精确定位信息，知道与 该疾病基因有紧密连锁关系的遗传标志 标本：血标本或其他组织标本（包括石蜡切片） 家系资料及标本：需要父代及先症者的DNA标本 遗传异质性的影响：大 DNA重组的影响：有,连锁分析是基于紧密连锁的基因或遗传标记通常一起传给子代，因而考察相邻DNA是否传递给了子代，可以间接地判断致病基因是否传递给子代。 连锁分析多使用基因组中广泛存在的各种DNA多态性位，特别是基因突变部位或紧邻的多态性位点作为标记。RFLP、VNTR、SSCP、AMPFLP等技术均可用于连锁分析。,二、基因异常与诊断方法的选用,各种遗传病的基因异常是不同的，同一遗

17、传病也可以有不同的基因异常，但这些异常大体可分为基因缺失和突变两大类型。后者包括单个碱基置换、微小缺失或插入。近年来发现一些遗传病是由于基因内的三核苷酸重复顺序增加引起的。,因此，根据对基因异常类型的了解，对基因诊断采用不同的方法进行。 然而，由于许多疾病的遗传异质性，以及多数遗传的基因异常尚属未知，目前能直接诊断的病种虽日益增多，但仍然是比较有限的。,遗传的基因诊断方法,三、遗传病的基因诊断举例,1基因缺失型遗传的诊断 （1）地贫的基因诊断：地贫主要是由于基因缺失引起的，缺失的基因可以为14个。正常基因组用BamH切割，可以得到一个14kb的片段，而缺失一个基因时切点向5端移位，得到一条10

18、kb的片段。,+ BamH I,14kb,正常,10kb,地贫,因此，当用基因探针与基因组DNA进行Southern杂交时，在地贫2可见一条14kb和一条10kb的带，正常人可见一条双份的14kb的带，而在地贫1则见一条单拷贝的14kb带，血红蛋白H病时只有一条10kb的带的，而在Barts水肿胎时，则无任何杂交带。,14kb,地贫2,10kb,正常,地贫1,HB H,Barts,（2）DMDBMD的缺失型诊断： DMDBMD是一种连锁隐性遗传的神经肌肉系统受累的致死性遗传病。 DMDBMD患者70为缺失型。该基因很大2370+Kb，有78个外显子。缺失可发生在不同部位，因此通常采用多对引物作

19、PCR扩增（多重PCR）来检测，目前常用18对引物扩增检测。,如扩增产物电泳后发现有带纹的缺失，即可作出诊断并对缺失定位。在进行产前诊断时，一般可先通过检测家系中有关成员，即确定先证者的缺失区，然后有针对性地作PCR扩增，包括缺失部分的两端，以判断胎儿或有关患儿是否也获得了相同的基因缺失，但非缺失型不能用此法查出。,2点突变型遗传病的基因诊断 （1）镰形细胞性贫血的基因诊断： 已知突变基因是编码珠蛋白链的第6位密码子由GAG变为GTG，从而使缬氨酸取代了甘氨酸，因此可用如下方法进行诊断。,1）RFLP诊断：已知限制酶Mst切割的识别顺序是CCTNAGG，它能切割正常链中CCTGAGG序列，但不

20、能切割突变了的CCTGTGG（AT）。这样，由于突变消除了一个切点，使内切酶长度片段发生了改变，通过电泳，就可以区别正常的A和S。除Mst外，限制酶Dde（识别序列为CTNAG）也能够把正常的A基因与镰变了的S基因区别开来，并用于诊断。,2）ASO探针诊断：由于突变部位和性质已完全明了，也可以合成寡核苷酸探针，用P32标化来进行诊断。此时需要合成两种探针: 一种与正常A基因序列完全一致，能与之稳定地杂交； 另一种与突变基因序列一致，能与S基因稳定杂交，但不能与正常的A基因杂交。根据杂交结果，就可以把发生了突变的S基因检测出来。,PCR技术问世以来，ASO诊断又有新的改进，即先PCR扩增长约11

21、0bp的基因片段，然后再与ASO探针杂交。这样可减少目的基因DNA用量，并降低与基因组DNA杂交时的非特异性信号。,3基因异常不明的遗传病的诊断 成年型多囊肾病（adult polycystic kidney disease,APKD）是一种常染色体显性遗传病，发病率高，约1000人中有1名致病基因的携带者，起病较晚，多在30岁以后，主要为肾和肝中出现多发性囊肿，临床表现为腰疼、蛋白尿、血尿、高血压、肾盂肾炎、肾结石等，最终可导致肾功能衰竭和尿毒症。,APKD基因定位在16p13，与珠蛋白基因3端相邻，但致病基因尚未克隆，基因产物的生化性质和疾病发病机理也尚未阐明。因此，目前只能用连锁分析来进

22、行基因的发病前诊断和产前诊断。 由于通过家系分析，已证实APKD的致病基因与珠蛋白基因3端附近的一段小卫星DNA序列即3HVR(3 hypervariable region)紧密连锁，而后者在人群中具有高度多态性，因此可以通过RFLP连锁分析进行诊断。,第六节 PCR技术在遗传病诊断中的应用,自从1985年PCR技术首次应用于遗传病基因诊断以来，已有近百种遗传病可用PCR技术进行诊断和产前诊断。目前，利用PCR技术诊断遗传病的途径主要有以下5个： 1. 基因突变位点的直接检出 2. 基因缺失的直接检出 3. 筛查与遗传病有关的点突变 4. 遗传多态性标记连锁分析间接诊断 5. 利用cmRNA逆

23、转录为cDNA进行分析或直接 分析cmRNA.,一、PCR技术诊断遗传病的基本条件 条件一：反应的过程中必须有酶和底物， 在这里酶为DNA聚合酶（Taq），该酶具有耐热性，底物为4种脱氧磷酸核苷酸。 条件二：引物，引物是根据已知的基因片段合成的一段20个左右碱基的寡核苷酸片断。 利用已知的基因结构合成一对引物是PCR诊断遗传病的最基本条件，也就是说，说遗传病的基因结构必须部分或全部清楚.,二、利用PCR技术诊断遗传病的途径 1.利用PCR技术直接诊断遗传病 对于由基因缺失突变引起的遗传病可利用缺失区域还侧的DNA序列引物直接扩增该区域，看有无特异性的扩增产物，这对缺失部位固定的片段检测非常准确

24、简便，只需一对引物即可完成。,对于那些缺失部位异质的基因则可利用多对引物进行多重PCR，然后检查缺失带。 对基因的重排来说，可通过用RT-PCR检测mRNA的融合情况来检出，插入亦可用PCR方法来检出。 当点突变影响到限制内性切酶切点时，可用PCR-RFLP进行分析，即将扩增产物用适当的内切酶切割，然后据电泳图谱复制判断有无内切酶切点的改变，它比传统的RFLP检测法快速简便，且不受同位素的危害。,若突变位点及性质已知，可用PCR-ASO，3特异PCR及引物竞争法进行确定，而对于突变位点不清楚或突变位点多变的基因则可用PCR-SSCP，TGGE，切割，异源双链分析长久法进行筛选与遗传病有关的点突变，再用PCR直接测序确定突变部位和性质。,2.利用连锁分析间接诊断遗传病 有的遗传病其基因结构庞大，基因的分子病理改变复杂或不清楚，或异质性较高，利用PCR技术直接检测与遗传病有关的基因点突变有一定的困难。这时，常利用基因内或其旁侧的一些多态性标记进行连锁分析，以间接判断是否有遗传性疾病。,三、PCR技术在产前诊断中的应用 （一）PCR技术在产前诊断中的地位： 传