2.1-2.2 遗传作图

1、2 遗传作图,遗传图与物理图 遗传作图标记 遗传作图的方法 遗传图绘制,结构基因组学,结构基因组学：基因组计划,基因定位 基因组作图 测定核苷酸序列,功能基因组学,利用结构基因组学提供的 信息和产物，在基因组系 统水平上全面分析基因的 功能的一门学科。,结构基因组的研究策略,DNA测序有一个极大的局限性：即使是最精确的技术，在一个反应中也很难测出大于750bp的序列。这就需要将大分子分解为片段。,问题：分析基因组的重复区域时会发生错误。,因此，必须首先建立一个基因组的图谱，通过标明基因和其他显著特征的位置，为测序提供指导。,为何要绘制遗传图与物理图？,1)基因组太大,必需分散测序,然后将分散的

2、顺序按原来位置组装,需要图谱进行指导。 2)基因组存在大量重复顺序,会干扰排序,因此要高密度基因组图。 3)遗传图和物理图各有优缺点,必须相互整合校正。,一旦得到了基因组的图谱，测序阶段可以采用以下方法进行： 1. 全基因组鸟枪法（whole-genome shotgun method） 全基因组鸟枪法是一种快速获得真核基因组的方法。 2. 克隆重叠群法（clone contig method）：（作图法测序，限制测序）。 这种逐步测序的方法花时间多，但精确。,鸟枪法测序,全基因组鸟枪法测序和克隆重叠群法测序最后 都必须将DNA序列回归到基因组图上，因此 基因组图的绘制是基因组测序和组装的核心

3、内容 之一，是基因组全面测序的必要前提。 传统上将基因组作图方法分为两类。 1. 遗传作图 2. 物理作图,2.1 遗传图谱与物理图谱,1）遗传作图（Genetic mapping）：采用遗传学分析方法将基因或其它DNA序列标定在染色体上构建连锁图。这一方法包括杂交实验，家系分析。遗传图距单位为厘摩(cM), 每单位厘摩定义为1%交换率。 2）物理作图（Physical mapping）：采用分子生物学技术直接将DNA分子标记、基因或克隆标定在基因组实际位置。物理图的距离依作图方法而异，如辐射杂种作图的计算单位为厘镭(cR), 限制性片段作图与克隆作图的图距为DNA的分子长度，即碱基对(bp,

4、 kb)。,遗传图谱：某一物种的染色体图谱（也就是我们所知的连锁图谱），显示所知的基因和/或遗传标记的相对位置。遗传图谱表明基因之间连锁关系和相对距离。 物理图谱：物理图谱描绘DNA上可以识别的标记的位置和相互之间的距离(以碱基对的数目为衡量单位)。 前者是描述的基因相对位置，后者是具体的碱基位置 。,通过遗传图谱，我们可以大致了解各个基因或DNA片断之间的相对距离与方向，如哪个基因更靠近着丝粒，那个更靠近端粒等 遗传距离是通过遗传连锁分析获得的，使用的DNA厘摩标志越多，越密集，所得到的遗传连锁图的分辨率就越高 遗传图谱不仅是现阶段定位基因的重要手段，即使在人类基因组全物理图谱建立起来之后，

5、它依然是研究人类基因组遗传与变异的重要手段。,2.2 遗传作图标记,任何一类图谱都有可识别的标记。遗传图谱的标记是什么呢？,遗传标记的类型: 基因标记 DNA标记 遗传标记的特征: 亲本间存在着多态性（即差异），也就是说具有可识别性。 亲本间存在的多态性在后代中可以重演，即具有可遗传性。,遗传标记（Genetic Markers）：遗传图有特征性的位置标记，用于表示基因组中特定顺序所在的位置。这些标记按孟德尔方式遗传。,2.2.1 基因是首先被使用的标记 在经典遗传学中，研究一种性状的遗传必须要求同一性状至少2种不同的存在形式或称表型。 起初只有那些能通过视觉区分的基因表型用于研究。最初的遗传

6、图谱是在20世纪初针对果蝇等生物使用基因作为标记构建的。,个体上可以看见的遗传标记基因，如花色（红花、白花）、株高（高秆、矮秆）等。 生化性状基因 ，如血型系列(ABO)分析、血清蛋白、免疫蛋白、同工酶等。,基因标记的缺点 高等生物，如 脊椎动物和显花植物等，可用作标记的基因十分有限，许多性状都涉及多基因； 高等生物基因组中存在大量的基因间隔区，纯粹用基因作为标记将在遗传图谱中留下大片的无标记区段； 只有部分基因其等位基因成员可以通过常规试验予以区分，因而产生的遗传图是不完整的，必需寻找其他有效的标记；,2.2.2 DNA标记 基因之外的作图工具统称为DNA标记。与基因标记一样，DNA标记必须

7、有至少两个等位基因才是有用的。有三种类型的DNA序列特征可以满足这一要求： 限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphisms, RFLP） 2. 简单序列长度多态性（simple sequence length polymorphisms, SSLP） 3. 单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms, SNP）,DNA标记具有的优势： 在数量上是巨大的； 操作相对简单，适合大规模开展工作； 标记比较明显，容易识别； 受环境影响少，标记本身就是遗传物质。,A. 最早发现的DNA分子标记RFLP：由于同源

8、染色体同一区段DNA序列的差异，当用限制酶处理时，可产生长度不同的限制性片段,RFLP:restriction fragment length polymorphism, 限制性片段长度多态性,同一物种的亚种、品系或个体间基因组DNA 受到同一种限制性内切酶作用而形成不同的酶切图谱的现象，称为限制性片段长度多态性（RFLP)。 这是由于基因组DNA某一位点上的变异有可能引起该位点特异性的限制性内切酶识别位点的改变，包括原有位点的消失或出现新的酶切位点，致使酶切片段长度随之发生变化而产生。,David Botstein,David Botstein开创核酸限制性片段 长度多态性分析技术，用于标志

9、不同 个体间的基因差别，为后来的人类基 因组计划奠定了基础。,对RFLP的检测主要是用Southern杂交的方法进行 基本流程： 组织或细胞基因组DNA限制性内切酶消化琼脂糖凝胶电泳印迹转移至滤膜加入探针杂交洗膜放射自显影获得反映个体特异性的RFLP图谱。,RFLP多态性的产生与检测,所用的探针位于染色体的不同位点，可以作为一种分子标记，构建分子图谱。,RFLP标记的主要特点是： （1）遍布于整个基因组； （2）无表型效应,不受发育阶段及器官特异性限制 （3）共显性，可区分纯合子和杂合子； （4）结果稳定、可靠；,共显性: （两个亲本的性状在一个个体中同时出 现，没有显隐关系）,问题： 克隆可

10、表现基因组DNA多态性的探针较为困难 DNA需要量大，实验操作较繁锁，检测周期长成本费用也很高。 RFLP分子标记分布密度过于稀疏。 现已逐步被其他类型分子标记所取代。 RFLP是最早发现的分子标记，也被称为第一代分 子标记。,B. 简单序列长度多态性(simple sequence length polymorphism, SSLP),1) 可变排列的简单重复序列, 即重复次数不一, 在染色体的同一座位重复序列拷贝数不同; 2) SSLP的类型: 小卫星序列(minisatellite), 有时又称可变串联 重复（VNTR），重复单位较长。重复序列为16-100个核苷酸，主要分布在染色体末端

11、。 微卫星序列(micrisatellite), 又称简单串联重 复（STR），或短串联重复（short tandem repeat，STR），重复单位较短。重复序列只有2-6个核苷酸，分布在整个基因组。,微卫星序列（SSR）,在微卫星DNA中，简单序列的重复次数在同一物种的不同品种或不同个体中存在着较大的差异。也就是说，微卫星座位上存在着非常丰富的等位基因。例如，在水稻中，RFLP座位的等位基因数为2-4个，而微卫星的等位基因数为2-25个。从多态性信息含量（polymorphism information content，PIC）来衡量，RFLP的PIC值为0.39，而微卫星的PIC大于0

12、.75。 由于微卫星座位具有丰富的等位基因，因此微卫星标记是一类比较理想的分子标记。,为什么微卫星比小卫星更常用做DNA标记？ 1）小卫星在基因组中分布不均匀，更常见于染色体末端。微卫星序列在整个基因组中分布均匀，而且密度高； 2）小卫星不适用于PCR分型，因为它的重复单位较长，可以形成20kb长的聚集区，而微卫星区较短，通常小于150bp，用PCR扩增时反应快又精确。 人类基因组约有6.5105个微卫星标记。,如何检测SSR,根据简单重复顺序两侧的序列设计引物, 经聚丙烯胺凝胶电泳分辩.,SSR在遗传学上的应用,基因组复制产生的“滑移”现象导致微卫星具有很大的变异性，这种变化造成任何两个个体

13、都不会有完全相同的微卫星变异组合。因此根据微卫星序列的差异可以建立每个人的遗传档案（genetic profile)，应用于法医鉴定。也用于鉴定可以珍稀动植物的亲源关系。,SSR的特点,1) 染色体上的位置相对固定; 2) 操作简单，可以用PCR分型; 3) 同一凝胶电泳可显示不同多态性片段, 表现为共显性； 4）有多种等位形式。,SSLP标记在基因组中的分布具有多态性频率高以及分布比较均匀的特点，此外SSLP标记可以采用PCR方法直接扩增，经聚丙烯胺凝胶电泳分辩，现已成为主流的分子标记，又称为第二代分子标记。,C. SNP Single Nucleotide Polymorphism，即单核

14、苷酸多态性 。 SNP是指同一物种不同个体基因组DNA的等位序列上单个核苷酸存在差异的现象。其中最少一种在群体中的频率不小于1；如果出现频率低于1，则视作点突变。,SNP的一些特点,1) 理论上同一碱基位置SNP等位型式最多为4，但多数为2； 2)大多数不能被限制酶识别，必须采取测序或寡聚核苷酸杂交检测； 3) 数量极大, 人类基因组平均每1 kb 含有一个SNP. 估计共有300万个SNP； 4) SNP与人类易感性疾病有关, 涉及药物基因组学； 5) 编码区SNP主要分布在密码子的第3个碱基位置。,在基因组编码序列中，SNP 大多位于密码子的摇摆位置，表现为基因沉默而被大量保留下来;数目多

15、，覆盖密度大，它的开发和应用摒弃了遗传标记分析技术的“瓶颈”凝胶电泳，为DNA芯片技术应用于遗传作图提供了基础。,SNP只涉及单个碱基的变异，这种变异可以由单个碱基的转换（包括C与T互换，G与A互换），或颠换（包括C与A、G与T、C与G、A与T互换）引起。,根据SNP在基因中的位置，SNP可分为： 基因编码区SNP（coding SNP, cSNP） 基因周边SNP（peripheral SNP, pSNP） 基因间SNP （intronicSNP, iSNP）,从对生物的遗传性状的影响，cSNP又可分为两种： 1.同义cSNP(synonymous cSNP)：SNP引起的编码序列的改变并不

16、影响其翻译的蛋白质的氨基酸序列; 2. 非同义cSNP（non-synonymous cSNP）：指碱基序列的改变可使以其为蓝本翻译的蛋白质序列发生改变，从而影响了蛋白质的功能，这种改变常是导致生物性状改变的直接原因。,大多数SNP位于非编码序列，不影响基因功能。有些SNP位置靠近特定的基因，可作为基因的标志。 其它的SNP位于编码序列内，可改变基因表达的蛋白质，从而影响人类健康。,如何检测SNP,1）DNA芯片技术：将待测的DNA用荧光标记物标记，点到玻璃或硅制的芯片表面（有原位合成的寡核苷酸），然后用荧光显微镜检测，发出荧光信号的位置表明寡核苷酸与待测的DNA杂交。 原理：DNA芯片技术以寡核苷酸杂交为基础。寡核苷酸是在试管中合成的通常小于50bp的短的单链DNA分子。在适当的条件下一个寡核苷酸只有在与另一个核酸分子形成完全的碱