总结 2016.ppt

1、分子医学技术,真核 基因组,PCR,质粒,凝胶过滤层析,SDS-PAGE,ELISA,真核生物基因组DNA提取教学内容,真核生物基因组的结构及特点、人类基因组计划 真核基因组提取的实验原理、操作说明及注意事项 基因组提取后的应用：基因组文库、PCR及southern blot RNA提取方法简介 核酸（DNA和RNA）定量及定性方法的介绍 核酸琼脂糖凝胶电泳的介绍（原理、凝胶分辨率、制备凝胶过程及核酸染料）及点样示教 微量移液器的使用,真核基因组具有独特的结构,核酸制备的一般原则,核酸制备时应注意的事项,分离纯化核酸总的原则： 应保证核酸一级结构的完整性； 排除其它分子的污染 。 核酸纯化应达

2、到的要求： 不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子； 其它生物大分子的污染应降低到最低程度； 排除其它核酸分子的污染。,尽量简化操作步骤，缩短提取过程。 减少化学因素对核酸的降解 减少物理因素对核酸的降解 防止核酸的生物降解（核酸酶）,核酸制备的步骤 核酸制备的常用试剂 核酸酶的抑制和抑制剂： DNase抑制、RNase抑制 去垢剂、蛋白质变性剂、酶,Dnase、RNase、 蛋白酶K、溶菌酶,1.材料准备 2.破碎细胞或包膜 3.核酸分离、纯化 沉淀法或吸附法 4.核酸溶解,核酸定性及定量检测方法： 定量紫外分光光度法（纯度和浓度） 定性琼脂糖凝胶电泳,对标准样品来说，浓度为1

3、g/mL时DNA钠盐的OD2600.02； OD2601时： dsDNA(双链DNA)浓度约为50 g/mL ssDNA(单链DNA)浓度约为37g/ml RNA浓度约为40g/ml 寡核苷酸浓度约为30g/ml,dsDNA 浓度（g/L）=OD260稀释倍数50 /1000 RNA 浓度（g/L）=OD260稀释倍数40 /1000,浓度的检测,纯度的检测,DNA纯品的OD260/OD280 约为1.8。 OD260/OD2801.9说明含有RNA污染； OD260/OD2801.6 说明有残余的蛋白质、酚等存在。 OD230/OD260的比值应在0.40.5之间，若比值较高说明有残余的盐存

4、在。 有些分光光度计则显示OD260/OD230，其比值应在22.5之间，偏小则说明有残余盐剩余。,RNA的纯度： OD260 /OD280 的比值在1.72.1较好， 比值较低，说明含有蛋白质污染； 比值太高，提示RNA有降解。,分离鉴定核酸的常规方法：琼脂糖凝胶电泳 原理 DNA分子在电场中移动方向 核酸分子在琼脂糖凝胶中的迁移率（5个因素） 真核基因组DNA提取后续的应用,构建基因组文库 Southern杂交 PCR,基因组文库构建,基因组文库就是含有某种生物全部遗传信息的重组DNA分子的克隆总和,Southern blot,总RNA的提取 严格防止RNase的污染 RNA电泳：可能是两

5、种rRNA (28s和18s)，条带亮度比例约2:1 条带弥散，说明RNA可能已降解。 若条带大小大于28s，则可能有基因组DNA的污染，用DNase I处理DNA污染较好,Lysis Buffer A： SDS（溶解膜性结构并使蛋白质变性，使核酸与蛋白分离） EDTA（螯合二价阳离子以抑制DNase） Tris-HCl （缓冲体） 蛋白酶 K：消化降解蛋白质 RNase A：去除DNA制品中的污染RNA,Lysis Buffer B：沉淀作用，内含有醋酸，提供低pH环境 DNA在高盐低pH的条件下，与硅基质膜特异性结合；在低盐高pH值条件下，吸附的DNA被洗脱下来 Wash buffer A

6、（含60%的乙醇） Wash buffer B（含80%的乙醇）：主要去除盐等杂质 Elution Buffer（EB）：主要是TE buffer,提供高pH值环境，使吸附的DNA被洗脱下来,PCR 教学内容,PCR技术基本原理 PCR仪的使用（示教） PCR体系各原料的作用、引物设计原则、循环设计原则 PCR技术的种类 PCR技术的应用 微量移液器的使用,PCR基本工作原理 模板DNA的变性：94左右，双链变单链 模板DNA与引物的退火(复性)：55左右，引物与模板互补结合 引物的延伸（碱基互补配对）：合成新链（新链+旧链=半保留复制链）,PCR体系基本组成成分： 模板DNA：来源、制备要求

7、 特异性引物：设计原则、引物量（10-100pmol/L） 耐热DNA聚合酶：浓度(2.5U/100uL) dNTPs：浓度（50-200umol/L） Mg2+：浓度(1.5-2.0mmol/L),PCR的基本反应步骤 PCR反应条件的选择与优化： 温度与时间：变性温度 退火温度*：引物长度、碱基组成及其浓度、靶基 因序列长度 延伸温度：时间根据靶基因长度而定 循环次数：取决于模板DNA的浓度,PCR的扩增产物：长产物片段和短产物片段两部分 PCR产物的检测: 琼脂糖凝胶电泳，核酸Marker 注意事项：降低外源核酸和核酸酶污染 PCR 反应特点：特异性强、灵敏度高、简便快捷、标本纯度要求低

8、 PCR的临床应用 PCR在分子生物学的应用 定量PCR技术,实时PCR技术原理,R - 报告基团 Q - 猝灭基团,重组质粒DNA的提取及酶切鉴定教学内容,酶切位点、黏性末端、平末端 载体的种类：克隆载体（质粒、噬菌体、酵母等）、表达载体 质粒DNA的特点 感受态细胞 用于提取质粒DNA溶液的各自作用 双酶切体系的作用原理 克隆技术的应用,常用工具酶,重组DNA技术中常用的工具酶 限制性核酸内切酶 “分子手术刀” 定义： 识别并切割双链DNA特异序列的一类核酸内切酶 识别序列特点回文结构 酶切末端：平端切口、粘端切口,重组DNA技术中常用的载体： 作用：运送目的基因高效转入受体细胞；为目的基

9、因提供复制能力；为目的基因的表达提供条件 特点：自主复制；多克隆位点：遗传标记；分子量小，拷贝数多 种类：克隆载体；表达载体,质粒克隆载体 与基因组区别（大小、构像） 一般特性：不是细菌生长所必需的；它能在细菌中垂直遗传并赋予宿主细胞一些表型；具有自主复制性（严紧型、松弛型）；相容性和不相容性；可转移性 分子构型： SC型（cccDNA）； OC构型； L构型 遗传标记基因：指示外源DNA分子（载体或重组体）是否进入宿主细胞；指示外源DNA分子是否插入载体分子形成了重组体 抗性标记基因（选择转化子），如抗生素抗性基因：Ampr, Strr等 生化标记基因：其表达产物可催化某些易检测的生化反应，

10、如lacZ,蓝白斑筛选,重组体的筛选与鉴定,重组DNA技术基本原理和操作步骤,化学合成法；基因组文库；PCR法,克隆载体；表达载体,粘端连接（相同、不同、其它）；平端连接；粘平连接,感受态细胞制备,蓝白斑筛选基本原理；结果判定,重组DNA技术操作的主要步骤,重组DNA技术在医学中的应用,转基因动、植物 基因诊断 基因治疗 基因工程药物,碱裂解法提取大肠杆菌质粒DNA的原理与方法,利用两种DNA的差异 质粒DNA分子较染色体DNA小，且具有超螺旋共价闭合环状的特点 用碱处理细菌，使细菌胞壁破裂，释放出细胞内容物 在高碱性（pH12左右）条件下，DNA变性： 染色体DNA解离成单链 超螺旋状态的质

11、粒DNA部分解离成单链,SDS破坏细胞膜；变性蛋白质并与之结合 加入HAc与KAc，恢复中性时，K+与SDS形成溶解度很低的盐PDS 染色体DNA由于较长，与蛋白质-SDS共沉淀；而质粒DNA由于较小，留在上清中（且准确复性） 用RNA酶消化除去RNA,各溶液的成分及作用,RB（Resuspension Buffer）：含RNase A，葡萄糖，Tris-HCl，EDTA LB（Lysis Buffer）：蓝色 ，含NaOH，SDS NB（Neutralization Buffer）：黄色，含乙酸钾和乙酸钠 WB（Wash Buffer）：高盐、低pH值 EB（Elution Buffer）：

12、低盐、高pH值,双酶切检测是否有目的基因插入,双酶切体系原理,蛋白质凝胶过滤分离纯化的基本原理 层析技术的种类及原理 分光光度计的原理及使用 标准曲线的制备,脲酶凝胶过滤分离纯化及活性测定教学内容,层析的基本原理：固定相、流动相 层析的分类： 凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析的原理、应用,脲酶活性测定的原理 蛋白质凝胶过滤层析的基本流程 标准曲线制备的基本要求 分光光度计的基本原理、使用及注意事项,蛋白质凝胶过滤层析基本流程,1.溶胀 5.加样 2.装柱 6.洗脱与收集 3.调整流速 7.层析柱再生 4.样品制备,聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质的基本原理和方法及基本操作流程 Western

13、Blot的基本原理及应用 蛋白质电泳的种类及原理 蛋白质分离纯化、含量测定及保存的方法及相应原理,SDS-PAGE 教学内容,聚丙烯酰胺凝胶电泳概念及基本原理 PAGE的分类 PAGE分离蛋白质的原理 SDS-PAGE的三个效应 PAGE的优缺点及其用途 Western blot的基本原理、操作过程、应用、优点、注意事项 蛋白质的提取、保存、分离纯化、含量测定的方法、原理、优缺点等,抗原抗体反应的一般特点、影响因素、应用 免疫标记技术的常用分类、应用 酶联免疫吸附试验的基本原理 酶联免疫吸附试验的主要类型：直接法、间接法、夹心法、竞争法、捕获法、生物素-亲和素ELISA法等，介绍原理及主要用途

14、 酶标仪的使用 使用微量移液器配制不同浓度液体,ELISA 教学内容,ELISA间接法的基本原理、操作流程、注意事项 ELISA实验中洗涤的方法 等倍稀释与等差稀释溶液的方法 血清学反应的特点、影响因素、应用、分类 ELISA的分类、原理、应用 酶标仪双波长的设定,实验操作过程中注意事项,加入一抗前需进行封闭（原因） 加入TMB（底物）及终止液（硫酸）后，溶液颜色变化,考 核 方 案,课程考核成绩分值与权重,期末理论考试,考试内容： 实验理论内容：80分 实验操作内容：20分 题型：共100道选择题，每题1分 单选80-90题 多选10-20题 笔试，涂答题卡 时间：具体安排待定，将由年级办通

15、知学生 考试时长60分钟 总分为100分，之后按0.5权重折合计入总成绩,实验操作考核方案,总计6项考核内容，每个实验台一项。 考核时间每场15分钟，每轮6名学生。 学生按学号顺序进入实验室后，随机抽取考试题目，进行操作。 由监考老师按操作考核标准当场打分，满分100分，超时完成者扣除10分。 之后按权重0.3折合，计入总成绩。 采取扣分制，即操作不当扣除相应分值。,实验操作考试要求,穿白大衣进入考场 不允许长发披肩、不允许携带手机等电子通讯设备，考试结束后不允许在考场外逗留；严禁扰乱考场秩序 请带好考试要求的相关证件（学生证） 请带好铅笔、橡皮、格尺 考试开始前有2分钟读题时间，请仔细阅读题

16、目纸，按照题目要求完成操作，并将相应结果填写到答题纸上 抽取到作图考试的同学，请将自己的班级、学号、姓名写到坐标纸背面，以便进行成绩录入 考试时间、地点将通过各年级办通知学生，请严格按照时间安排提前20分钟到达指定考场,实验操作考核内容及标准,1.使用微量移液器配制不同浓度的液体 2.分光光度计及比色皿的使用 3.电泳上样及电泳仪的连接 4.利用酶标仪测定倍比稀释液体光密度值 5.曲线制备（直线、曲线）,使用微量移液器配制等差浓度的液体,移液器选择不当，用大量程的移液器吸取小体积液体（5分） 移液器与枪头不匹配（5分） 枪头安装方式不正确（5分）（如剁枪头） 量程调节不规范（5分）（如超出量程

17、、调节速度过快、带枪头调量程等） 吸液体方式不正确 枪头伸至样品液面下后按吸入档（5分） 直接按至第二档吸液（10分） 吸液时移液器倾斜，导致移液不准（5分） 吸液时移液器进入试剂瓶内过多或试剂瓶放置距离过远（5分）,使用微量移液器配制等差浓度的液体,排液体方式不正确： 排液时微量移液器垂直，未贴容器内壁成一定角度（5分） 排液时按到第一档未作停顿，直接按至第二档（5分） 排液时未按至第二档，导致洗头有残液（5分） 吸液或排液时速度过快，未慢吸慢放，导致液体体积不准确（5分） 平放或倒放带有残余液体吸尖的微量移液器（5分） 直接用手卸掉吸尖或废枪头未打入废液缸中（5分） 用完后未将移液器调至最

18、大量程处（10分） 未按要求等差稀释试剂或配制浓度不正确（10分） 实验结束后未整理实验台（5分）,分光光度计及比色皿的使用,未开机预热（5分） 开机预热时未开盖（5分） 开机预热前未调整波长（5分） 开机预热后未调节功能键至“T”档（5分） 手持比色皿方式错误（5分） 比色皿内液体量过多，超过3/4（5分） 比色皿未正确放入样品仓（5分） 分光光度计未调零或调零方式不正确（10分）,分光光度计及比色皿的使用,更换比色皿内试剂过程不正确，包括倾倒（5分） 、扣干（5分） 、润洗（5分） 擦拭比色皿外壁方式错误（5分） 测量时参数设定错误（5分） 测量时拉动拉杆位置错误（5分） 各种原因致液体洒

19、入机器内部（5分） 测量结束后未清洗比色皿（5分） 比色皿清洗后放置方式错误（5分） 测量结束后未整理实验台（5分）、未关机（5分）,电泳上样及电泳仪的连接,胶板放置方向错误（10分），未加电泳缓冲液即上样（5分） 在封口膜上混合DNA样品和上样缓冲液，上样缓冲液的最终稀释倍数应为1（10分） 例：以6和10的上样缓冲液为例 如果选6的上样缓冲液：1uL上样缓冲液 + 5uL样品 如果选10的上样缓冲液：1uL上样缓冲液 + 9uL样品 微量移液器上吸取极微量液体的方式不正确（10分） 微量移液器使用不规范（10分） 用微量加样器混匀样品及上样缓冲液方式不正确（10分）,样品未加到加样孔中或漂

20、样（10分） 划裂或戳漏凝胶板（10分） 上样完毕后，未将吸尖弃至旁边的污物桶中（5分）（注意应按下小按钮，不用手退吸尖） 未正确区分污染区和非污染区的操作（10分） 未正确调节电泳仪（10分）,电泳上样及电泳仪的连接,酶标仪的使用 利用酶标仪测定等比稀释溶液OD值,未开机预热（10分） 未按操作要求倍比稀释待测溶液（10分） 使用微量移液器加液时枪头接触酶标板底部（5分） 微量移液器使用不规范（15分） 设定待测溶液组别错误（10分） 酶标板放置方向错误（5分）,酶标仪的使用 利用酶标仪测定等比稀释溶液OD值,波长选项设置错误（10分） 波长数值设置错误（10分） 数据读取错误（5分） 实验

21、结束后未整理实验台（10分） 实验结束后未关机（10分）,标准曲线制备（直线、曲线）,未用铅笔作图（5分） 不能准确描记每个点（5-6个点，每个点5分） 未正确标注曲线名称（5分） 未正确标注横、纵坐标名称及单位、单位量、原点（每项5分） 未标注制图人、制图日期（每项5分） 根据已知点绘制曲线不合标准（10分） 直线：若各点不在一直线，则可通过原点，尽可能使直线通过更多点，使不在直线上的点尽量均匀地分布在直线的两边。 曲线：平滑曲线 未标记未知点（5分），并未利用描记曲线读取未知点的相应参数（5分）,练习题,凝胶过滤层析时，最先分离的物质是: A. 小分子物质 B. 大分子物质 C. 蒸馏水

22、D. 大小分子同时 答案: B,脲酶活性测定是根据,A. 脲酶水解尿素生成氨的量，即反应产生黄色化合物的吸光值 B. 脲酶水解丙酮酸生成乳酸 C. 反应生成蓝色化合物的吸光值 D. 反应生成白色化合物的吸光值 答案: A,交联葡聚糖SephadexG-200层析柱分离纯化脲酶时所用的洗脱剂是,A. 冷丙酮 B. 磷酸缓冲液 C. 蒸馏水 D. Nessler试剂 E. 脲酶粗提液 答案: C,测定脲酶活性时，加入Nessler试剂后所测波长是,A. 280 nm B. 480 nm C. 520 nm D. 620 nm 答案: B,以下选项不属测定蛋白浓度测定的方法是,A. 紫外分光光度法

23、B. Bradford法 C. Lowry 法 D. 琼脂糖凝胶电泳法 答案: D,紫外分光光度法测定蛋白含量是根据蛋白质在（） nm 处有光吸收值,A. 260 B. 280 C. 320 D. 450 答案: B,关于分光光度计用法正确的是,A. 打开开关后至少预热20 min。 B. 样品溶液倒入比色杯时应倒满。 C. 每测一次样品需要用擦镜纸拭擦比色杯内外。 D. 样品仓内比色皿磨面对准光路。 答案: A,SDS-PAGE中巯基乙醇的作用是,A. 阴离子去污剂 B. 螯合金属二价离子 C. 交联作用 D. 破坏蛋白质分子内二硫键 答案: D,常说的T%聚丙烯酰胺凝胶浓度中T%是指,A.

24、 SDS的浓度 B. Bis占Acr和Bis总克数的百分比 C. Acr的浓度 D. Acr和Bis总浓度 答案: D,Western 印迹技术是,A. 蛋白与蛋白杂交 B. 蛋白与DNA杂交 C. DNA与DNA杂交 D. RNA与RNA杂交 答案: A,RNA的印迹分析称为,A. Southern blot B. Western blot C. Northern blot D. Dot blot 答案: C,进行Western blot，转膜时所做的“三明治” 结构是:,A. 从正极依次是海绵垫片-3层滤纸-PVDF膜-样品凝胶-3层滤纸-海绵垫片 B. 从负极依次是海绵垫片-3层滤纸-P

25、VDF膜-样品凝胶-3层滤纸-海绵垫片 C. 从正极依次是海绵垫片- PVDF膜-3层滤纸-样品凝胶-3层滤纸-海绵垫片 D. 从负极依次是海绵垫片- PVDF膜-3层滤纸-样品凝胶-3层滤纸-海绵垫片 答案: A,目标蛋白是人的生长因子A蛋白，若想用Western blot法检测其表达，关于抗体的说法正确的是,A. 一抗是人抗鼠A抗体，二抗是羊抗鼠抗体 B. 一抗是鼠抗人A抗体， 二抗是羊抗鼠抗体 C. 一抗是人抗鼠A抗体，二抗是羊抗人抗体 D 一抗是鼠抗人A抗体，二抗是羊抗人抗体 答案: B,需要用酶标仪的实验是,A. ELISA B. SDS-PAGE C. 质粒提取 D. 脲酶的凝胶过

26、滤层析 E. PCR 答案: A,基因组DNA提取后通过电泳可检测提取DNA的质量。电泳后，较高纯度的基因组DNA应该有（ ）条带,A. 1条 B. 2条 C. 3条 D. 4条 答案: A,核酸进行琼脂糖凝胶电泳时，需要与（）混合后才能进行点样,A. 电泳缓冲液 B. 溴酚蓝 C. 巯基乙醇 D. 上样缓冲液 答案: D,关于微量移液器的用法，说法正确的是,A. 吸取液体时直接按到第一档 B. 吸取液体时直接按到第二档 C. 吸取液体时先将吸头深入液体后按压 D. 推液体时应快速按到第一档，直至液体全部推出 答案: A,与原核生物基因组比较，真核生物基因组,A. 均由编码序列组成 B. 均是

27、单拷贝序列 C. 不与组蛋白结合 D. 含有假基因 答案: D,关于真核生物基因组，下列说法错误的是,A. 含有内含子和外显子 B. 是断裂基因 C. 编码序列要大于非编码序列 D. 含有大量的重复序列 答案: C,限制性酶切后产生的黏性末有助于,A 产生新切点 B 与其他片段的连接 C 载体的环化 D 外源基因的表达 答案: B,大约60%人的基因具有可变剪接。关于可变剪接的说法正确的是,A. 可变剪接后可使大部分蛋白质序列发生改变 B. 前体mRNA剪接加工成结构相同的mRNA C. 不同前体mRNA剪接成相同mRNA D. 前体mRNA剪接加工成表达后功能相似的mRNA 答案: A,人类

28、基因组含有_个基因,A. 1.5万 B. 2万-2.5万 C. 10万 D. 3.0109 答案: B,DNA提取过程中RNaseA的作用是,A. 核酸外切酶 B. 复制RNA C. 去除RNA制品中的污染DNA D. 去除DNA制品中的污染RNA 答案: D,DNA样品的OD260/OD2801.9，说明,A. 含有RNA污染 B. 已降解 C. 有小分子盐污染 D. 有蛋白质、酚污染 答案: A,提取RNA实验的关键是防止_的污染,A. DNase B. RNase C. 核酸酶 D. 核酸外切酶 答案: B,最理想的高纯度的总RNA经电泳后，显示_条带,A. 1 B. 2 C. 3 D.

29、 4 答案: C,提取总RNA电泳图如下，条带a和b分别代表,A. 28s和23s rRNA B. 23s和18s rRNA C. 28s和18s rRNA D. 18s和5s rRNA 答案: C,抗原抗体反应的最适pH（ ）,A. 35 B. 56 C. 68 D. 接近抗原或抗体的等电点 答案: C,双抗体夹心ELISA适用于检测,A. 可溶性大分子抗原 B. 未知抗体 C. 未知抗原或抗体 D. 颗粒性抗原 E. 可溶性小分子抗原 答案: A,下列序列中认为哪一个最有可能是二类限制酶切位点,A. GAATCG B. GCTATG C. GGGCCC D. AGGGGCA 答案: C,在_诱导下，目的蛋白与lacZ就会以融合蛋白的形式表达出来,A. dNTP B. IPTG C. DMSO D. SDS 答案: B,制备感受态细胞的最佳温度是,A. 0 B. 4 C.10 D. 16 答案: A,检测抗原或抗体的体外实验包