血清学实验技术.ppt

1、概述,定义：免疫学技术是根据抗原抗体特异性结合原理建立的各种检测、分析技术的总称 分类： 体外免疫检测技术：常以免疫血清作为抗体的来源，故又称为血清学试验 细胞免疫技术：用于检测和研究集体的细胞免疫功能与状态 免疫制备技术：如抗体制备、纯化、标记技术等,血清学试验类型,凝聚性试验：凝集试验，沉淀试验 标记抗体技术：荧光、酶、放射性同位素标记技术等 有补体参与的试验：补体结合试验等 中和试验：病毒中和试验等 免疫转印技术 免疫传感器技术,血清学反应的一般特点,特异性与交叉性:抗原抗体结合的特异性是抗原分析和疾病诊断的基础；但不同微生物的部分共同抗原或不同抗原的相同表位可出现交叉反应，后者是区分血

2、清型或亚型重要依据 结合比例:抗原抗体结合在比例适当时才出现明显可见反应,抗原或抗体过多可抑制可见反应,称为带现象 可逆性:抗原抗体结合力与非共价键性质、数量和距离有关,形成的复合物可以解离, 离解常数(K)反映抗体与抗原之间的亲合力,高亲合力结合不易解离 反应的阶段性:特异结合迅速(几秒-几分钟),可见反应阶段较长,在凝集试验（颗粒性抗原）中，常因抗体过剩出现前带现象，故需固定抗原稀释抗体；而在沉淀试验（可溶性抗原）中，可因抗原过剩出现后带现象，故需稀释抗原,影响血清学反应的因素,抗体:包括抗体动物来源、浓度(效价)、亲和性等 抗原:包括理化特性(可溶性，颗粒性)和抗原表位数目及种类 电解质

3、:无电解质存在不出现可见反应(沉淀或凝集),一般用生理盐水作为抗体和抗原稀释液,有时需特殊电解质,但盐浓度过高会出现非特异性蛋白沉淀(盐析) 酸碱度:反应一般在pH6-9范围内进行 温度:一般在37或室温进行,较低温度(如4)出现可见反应慢,但特异性强,温度过高会使已结合复合物解离 时间:出现可见反应需要一定时间,应在一定时间内观察结果或终止反应,血清学试验的优点,特异性强，敏感性高 检测样品用量少，预处理较简单 试验方法多，可择优选用 方法简易、快速 可用于抗原或抗体的定性、定量、定位检测,血清学试验的应用,抗原抗体定性检测: 疾病诊断 血型鉴定 病原微生物分型鉴定 抗原抗体的定量检测: 抗

4、原或抗体效价测定 免疫效果跟踪检测 流行病学调查 其它生物活性物质定量分析 抗原定位检测:借助光学和电子显微镜,在细胞和亚细胞水平研究病原微生物及其表达产物与宿主细胞的关系,凝聚性试验,定义：抗原与相应抗体结合形成复合物，在电解质存在下相互凝聚成肉眼可见的凝聚物或沉淀物 分类 凝集试验：细菌、红细胞等颗粒性抗原或与颗粒性载体（红细胞、乳胶等）结合的可溶性抗原与相应抗体结合，在电解质参与下形成肉眼可见的凝集团块 沉淀试验：可溶性抗原与相应抗体结合，在电解质参与下形成肉眼可见的沉淀物,凝集试验分类,凝集性试验,直接凝集性试验,间接凝集性试验,玻片凝集性试验,试管凝集性试验,生长凝集性试验,正向间接

5、凝集性试验,反向间接凝集性试验,协同凝集性试验,间接凝集抑制试验,抗球蛋白试验,直接法,间接法,玻片凝集试验,属于直接凝集和定性试验 可用于未知(待测)抗原或抗体检测 快速简便，1-3分钟内观察结果，出现凝集颗粒为阳性反应 主要用于细菌分型鉴定、疾病诊断（如布氏杆菌和鸡白痢检疫)和血型鉴定,试管凝集试验,多用已知抗原进行血清抗体的定性和定量（效价或滴度）检测，可用于疾病诊断和流行病学调查 常用生理盐水将待测血清作倍比稀释，与等量抗原混合，反应温度和时间视抗原种类决定 判断标准:+(100%凝集),+(75%凝集),+(50%凝集),+(25%凝集),-(不凝集),出现50%以上凝集的血清最高稀

6、释倍数为该血清的凝集价(滴度) 注意阳性和阴性对照,适当稀释待检血清以避免前带现象，有些细菌（如R型细菌）悬液不稳定，易出现自凝现象 根据凝集反应原理可制备单因子血清,间接凝集试验,定义：将可溶性抗原或抗体吸附在免疫无关的颗粒载体上，然后与相应抗体或抗原进行的凝集反应 常用载体：红血球(间接血凝试验)和乳胶(乳胶凝集试验)等，将可溶性抗原吸附在颗粒载体表面的过程称为致敏 分类： 正向间接凝集试验：将抗原吸附载体检测抗体 反向间接凝集试验：将抗体吸附载体检测抗原 一般在微量反应板上进行 可用于抗原或抗体的效价测定，具有简单、方便和较准确等优点,协同凝集试验,葡萄球菌A蛋白(SPA)是大多数金黄色

7、葡萄球菌细胞壁上的一种蛋白质 SPA能与人和动物(猪、犬、兔、猴、豚鼠) IgG Fc片段非特异结合 与抗体结合的SPA菌体称为致敏菌体,可与抗原(细菌、病毒、毒素等)发生快速凝集,称为协同凝集试验 主要用于传染病的快速诊断,SPA菌体还可用于IgG纯化,葡萄球菌,抗体,抗原,抗球蛋白(Coombs)试验,本质：间接凝集试验 原理：不完全抗体(单价抗体)与颗粒抗原结合不出现可见凝集反应，用单价抗体免疫动物,将获得的抗抗体与结合有单价抗体的颗粒载体混合，出现可见的凝集反应 应用：初生动物自身免疫溶血性贫血诊断，布氏杆菌病的不完全抗体检测，抗组织细胞不完全抗体的检测,沉淀试验分类,环状沉淀试验,在

8、小口径玻璃管内进行 主要用于抗原的定性检测(如诊断炭疽病的Ascoli试验、链球菌的血清型鉴定、血迹鉴定和沉淀素的效价滴定 出现白色沉淀环的抗原最高稀释倍数为该血清的沉淀价,已知血清,待测抗原,沉淀环,免疫浊度测定,原理：抗原抗体复合物在特定的稀释液中容易析出,从而发生浊度变化，当抗体浓度固定时,在一定范围内抗原和抗体混合物的浊度与抗原的量呈正比 仪器及要求：需要制备标准曲线，现多与光学仪器和自动化检测系统向结合 应用：可检测微量的抗原或抗体,单向单扩散试验,抗原在含阳性血清凝胶中单方向扩散形成沉淀线,随扩散的进行,已形成沉淀线不断溶解并形成新的沉淀线,导致沉淀线不断前移,最终形成稳定沉淀线

9、沉淀线距离与抗原量呈正比 主要用于抗原的定量测定,含已知抗体凝胶,待检抗原,沉淀线,琼脂凝胶扩散试验,定义：将可溶性抗原和抗体在半固体琼脂凝胶中扩散，当两者相遇并达到比例适当时出现肉眼可见的沉淀线 分类： 单向单扩散 单向双扩散 双向单扩散 双向双扩散（免疫扩散试验）,双向单扩散试验,基本原理,诊断鸡马立克氏病的羽囊琼扩试验,病鸡羽毛根,免疫扩散试验,原理: 不同孔中的抗原、抗体在凝胶中自由扩散,由近及远形成浓度梯度,当两者相遇且比例适合时形成复合物(沉淀线) 用途:主要用于复杂抗原分析,免疫电泳,本质：电泳与双向免疫扩散相结合 原理：琼脂的SO4-使溶液因静电感应产生正电荷,形成向负极的推力

10、(电渗力),带正电的分子在电渗力作用下加速向负极泳动,带负电分子克服电渗力向正极泳动 用途：血清蛋白的分析及疾病诊断,对流电泳,本质：用电泳加速抗原抗体定向扩散 原理：大部分抗原带较强负电荷,能克服电渗力向阳极泳动,IgG带弱负电荷，不能克服电渗力而向阴极移动，两者相遇时形成沉淀线 应用：主要用于快速诊断,火箭电泳,原理：在含抗血清的琼脂凝胶(pH8.2)中，加在阴极孔中的抗原在电泳力作用下向阳极泳动, 形成浓度梯度,在与抗体比例适合处形成沉淀峰, 峰的高度与抗原含量呈正比 应用：主要用于抗原定量分析,免疫标记技术,用酶或荧光素等示踪物标记的抗体或抗原进行反应,借助光学或酶学仪器对结果进行直接

11、观察或自动化测定,在细胞及亚细胞水平上对抗原进行定性和定位分析,免疫荧光技术,原理：用荧光素标记的抗体进行抗原抗体反应,然后在荧光显微镜下观察结果,进行抗原(如病毒感染细胞)的定性、定位研究 分类： 直接法：标记第一抗体，特异性高，操作简便，较快速，但一种标记抗体只能检查一种抗原，敏感性较差 间接法：标记抗抗体，既能检查抗原，也能检查抗体，一种标记抗抗体能与同种所有动物的抗体结合，敏感性高，但参与加因素较多，判定结果有时较难，操作繁琐 常用的荧光素：异硫氰酸荧光素(FITC)等,免疫酶技术,将抗原抗体反应的特异性与酶的催化高效性相结合的一类技术 可用于抗原和抗体的定性、定位或定量研究 主要包括

12、免疫酶组化染色技术和酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbant assay, ELISA),免疫酶组化染色技术,原理与免疫荧光相似,主要在病例切片或培养细胞上进行 常用的标记酶为辣根过氧化物酶(HRP) 分为直接法(标记第一抗体)、标记抗抗体) 、抗抗体搭桥法和杂交抗体法,酶联免疫吸附试验,将抗原或抗体吸附于固相载体(如聚苯乙烯微孔板)上,然后与相应的抗体或抗原反应,酶底物显色后用肉眼或酶联免疫测定仪进行定性观察或定量测定 主要有间接法、竞争法和双抗体夹心法 应用:用于抗原或抗体的测定,进行传染病的诊断及流行病学调查;用于抗原或抗体的含量或效价测定,ELISA的结

13、果判定,肉眼:根据反应孔内液体的颜色进行定性观察 仪器: P/N值判定法:被检样本(P)OD值与阴性样本(N)OD值的比值(P/N)1.5为阳性 样本的平均OD值大于阴性样本OD平均值+两个标准差+0.2-0.4为阳性,放射免疫技术,将抗原抗体反应的特异性与放射免疫测定的高度敏感性相结合 主要有液相放射免疫测定法和固相竞争测定法 主要用于微量抗原的定性和定量分析,补体结合试验,包括反应系统(抗原和抗体)、补体和指示系统(被溶血素致敏的红血球) 特别烦琐,影响因素多,现很少用,反应系统,指示系统,溶血反应,结果判定,抗体,抗原,补体,溶血素+红细胞,免疫转印技术,以标记抗体为探针的蛋白转印杂交 基本过程包括待测蛋白样品的电泳分离、蛋白向杂交膜(硝酸纤维素膜)的转移、杂交膜的封闭、用标记抗体进行的杂交、洗涤和信号显示,