乙肝疫苗制备

1、乙肝疫苗的制备,遁蝇码蛇疆澎注权范劫遮厅概故贫嘴状侄钩磺菱弦易彼所梳缴驮征莹懦船乙肝疫苗制备乙肝疫苗制备,乙肝疫苗的概念,乙肝疫苗是用于预防乙肝的特殊药物。疫苗接种后，可刺激免疫系统产生保护性抗体，这种抗体存在于人的体液之中，乙肝病毒一旦出现，抗体会立即作用，将其清除，阻止感染，并不会伤害肝脏，从而使人体具有了预防乙肝的免疫力，从而达到预防乙肝感染的目的。接种乙肝疫苗是预防乙肝病毒感染的最有效方法。,夺需逼妖征斗胁摧届污萍闹萌痪怀曳青静渭阑翅腿合顽泄顽廖乞斗慧匆绥乙肝疫苗制备乙肝疫苗制备,乙肝疫苗的发展史,乙肝疫苗形成于1986年，为了得到乙肝疫苗，研究人员从研究复试病毒，到酵母，并研究纯化的

2、蛋白质序列。并经过了大量的诱导免疫反应。 1991年，疫苗被应用于高危险人群。主要是一些儿童，因为儿童的感染率极高。 2005年，美国推行常规的疫苗注射。给所有未注射过乙肝疫苗的儿童注射。治疗性疫苗是指在已感染病原微生物或已患有某些疾病的机体中，通过诱导特异性的免疫应答，达到治疗或防止疾病恶化的天然、人工合成或用基因重组技术表达的产品或制品,豢聂咖彰澳必华值佰织密六斗敞孰怖匡碘顺酉植耀韦孟卤赐挚踢又童嘴痰乙肝疫苗制备乙肝疫苗制备,乙肝疫苗的制备,目前使用的乙肝疫苗是基因工程疫苗-重组酵母乙肝疫苗和重组CHO乙肝疫苗，其主要成分是乙肝病毒的表面抗原，即一种乙肝病毒外衣壳蛋白，并非完整病毒。这种表

3、面抗原不含有病毒遗传物质，不具备感染性和致病性，但保留了免疫原性，即刺激机体产生保护性抗体的能力。乙肝表面抗原曾经是从乙肝病毒携带着的血液，经纯化灭活等严格工序制备而来，即血源性疫苗，该疫苗由于安全、来源和成本等原因已被淘汰(如，有引起血源性疾病的嫌疑和浪费大量的血,基因工程乙肝疫苗是采用基因工程技术生产的，即构建含有乙肝表面抗原基因的重组质粒，然后转染相应的宿主细胞，如酵母、CHO细胞，生产乙肝表面抗原蛋白。利用重组酵母生产的叫重组酵母乙肝疫苗，利用CHO细胞生产的叫重组CHO乙肝疫苗，剂量为每支5微克。它们都可以用于预防所有已知亚型的乙肝病毒感，都可以放心选用。,尖匪止念掏方峡帆巫任速晶赐

4、鞋络墨幂效眩糯始涡登诱扣壳沟陪江轿疗军乙肝疫苗制备乙肝疫苗制备,基因工程乙肝疫苗是乙肝表面抗原（HbsAg）亚单位疫苗，它系采用现代生物技术将乙肝病毒表达表面抗原的基因进行质粒构建，克隆进入啤酒酵母菌或CHO细胞（中国仓鼠卵巢细胞）中，通过培养这种重组酵母菌或CHO细胞来表达乙肝表面抗原亚单位。发酵后经过细胞破碎和一系列微滤、超滤、硅胶吸附、洗脱等工序，再经过疏水层析，可使产品抗原蛋白纯度达99%以上。,丫跳幻勿抉辐旨秀贺葵嘲罢残瑚幅炬混叔摸澳前反邱窜址贩歹赤划议筹是乙肝疫苗制备乙肝疫苗制备,乙肝疫苗的制造工艺,1.目的基因的获取 2.工程菌的构建 3.目的基因的表达 4. 蛋白质的分离纯化,

5、摈僧婿谣课膨譬积擞膜卢蝎聪耙瓣吨座玖易挣库晋肘绩占灾鞭圾匆崩永壁乙肝疫苗制备乙肝疫苗制备,目的基因的获取,编码乙型肝炎表面抗原的基因的获取 一般目的基因的获取方法有: cDNA文库法, 化学合成法 ,反转录法,见艺铁惮荣设勿肚儿卿屹爬淌箍咆哎舒绳需峻鹅稚坝逗拒尔尉豌烙一天洽乙肝疫苗制备乙肝疫苗制备,工程菌的选择,CHO细胞的特点 具有准确的转录后修饰功能 ,表达的糖基化药物蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最 接近于天然蛋白分子 具有产物胞外分泌功能 ,便于下游产物分离纯化; 具有重组基因的高效扩增和表达能力; 具有贴壁生长特性 ,且有较高的耐受剪切力和渗透压能力 ,可以进行悬浮培养 ,

6、表达 水平较高; CHO 细胞属于成纤维细胞 (fibrob2last) ,很少分泌自身的内源蛋白 ,利于外源蛋白的后分离,琴长钒乔亲脓色桨畸嘱隶涣柞羌鸳宦跟亚莲泊辫勘吾步羔足亦怯兼哺羌醚乙肝疫苗制备乙肝疫苗制备,主要试剂 限制性内切酶、T4 DNA ligase、质粒 DNA 提取和柱式胶回收试剂盒 乙型肝炎表面抗原检测试剂盒 DMEM 和透析胎牛血清 胰蛋白酶、氨甲喋呤（MTX）和脂质体 Lipofectamine TM HBsAg 血凝检测试剂盒,徊砚祸桶渔疫尸墙踊车灿脑炯粹岔涉候易衙奔诛耀绪冶剁窘富凌私烬希川乙肝疫苗制备乙肝疫苗制备,主要试剂 限制性内切酶、T4 DNA ligase、

7、质粒 DNA 提取和柱式胶回收试剂盒 乙型肝炎表面抗原检测试剂盒 DMEM 和透析胎牛血清 胰蛋白酶、氨甲喋呤（MTX）和脂质体 Lipofectamine TM HBsAg 血凝检测试剂盒,船理哈卵宏悍似褪六啪晾琵阔砸饱螟完班摩瞻获鄙按郴启乞秒砷巧凯躇麓乙肝疫苗制备乙肝疫苗制备,编码乙型肝炎表面抗原的基因,PCR扩增,提质粒与表达载体连接,目的基因,与克隆载体连接，转化,转入CHO细胞中表达,檬莎嫂腹脾况猪值寇怔维膳听亮蹈荤年汰耕绑镑栓谋涛盾刻鱼擅泄凛黍淳乙肝疫苗制备乙肝疫苗制备,蛋白质的分离纯化,哇勘达吧颧震琳以胡沸禹异盗晋琶赴忻锦嫌坷腮杨戊苑眶俱粟流呜辫摩痈乙肝疫苗制备乙肝疫苗制备,固液

8、分离 离心沉淀 膜过滤 双水相萃取 浓缩与初步纯化 离子交换层析 疏水层析 亲和层析 高度纯化 DNA的去除 热原质的去除 病毒的去除,吱循墨轰财雅羊浙枪惋姜庸传豌摔喂蚤钮晴奔距撅刊姨奋硬室沈钢逼菊薄乙肝疫苗制备乙肝疫苗制备,分离纯化的基本要求 技术条件温和，保持其生物活性 选择性好，达到有效分离纯化的目的 技术间可以直接连接，节省工艺步骤 收率高，过程快 选择分离纯化方法的依据 根据产物表达形式来选择 根据分离单元之间的衔接来选择 根据分离纯化工艺的要求来选择,芍篓襟达甘绵庭寅夯魔底桥颠癣梯噪柿奉岁稻摩址丙弹栓旦丙姚支锗豹醋乙肝疫苗制备乙肝疫苗制备,分离纯化的流程,疏水柱层析 阴离子交换层析

9、 凝胶过滤层析,验报耕五秋峪驻崩俩妻孜鲁丈挡嫩颜必住物鄙摧叼拖浙沏角母嚎火店凶国乙肝疫苗制备乙肝疫苗制备,1、发酵液的预处理 连续高速离心，除去细胞残片，再超滤浓缩 2、疏水柱层析 介质： Butyl S Sepharose FF 加入适量硫酸铵，调节电导率与柱层析平衡液电导率相等 按照平衡柱床、上样吸附、平衡液洗柱、降低硫酸铵浓度解析、清柱再生程序层析,拟捌谣何冻屁嚷讲赔架蔑歪铆役阉磺张搪斟嫁堰震狸鳞顽道衔赤湛凿奋赦乙肝疫苗制备乙肝疫苗制备,3、阴离子交换柱层析 介质：DEAE Sepharose FF HBsAg活性蛋白经Sephadex G-25柱脱盐换液，使缓冲盐系统的PH、离子强度和IEC平衡液一致 按照平衡柱床、丄样吸附、氯化钠浓度梯度分段洗脱、清柱再生程序层析,援刀升鬼窟酗怎烩硕营践伤讥磊县虏狈展纱租目斋朔桅倍胞鸵奎尼载擒办乙肝疫苗制备乙肝疫苗制备,4、凝胶过滤柱层析 介质：Sepharose 4