课题3　血红蛋白的提取和分离

1、思考1 分离生物大分子的基本思路是什么？,选用一定的物理或化学的方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。,思考2 蛋白质的分离和提取的原理是什么？,根据蛋白质各种特性的差异,分子的形状和大小,所带电荷的性质和多少,溶解度,分离不同蛋白质,吸附性质,对其他分子的亲和力,思考3 高温灭菌和灼烧灭菌分别利用蛋白质的何种作用，作用结果是什么被破坏？,变性、变性、空间结构,血红蛋白,本课题学习目标,体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法，并了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理。 1、主要概念：凝胶色谱法 电泳法 缓冲溶液 它们在血红蛋白的提取中分别起到什么作用。 2、主要原理：凝胶色

2、谱法分离蛋白质的原理 电泳法分离样品的原理 缓冲溶液的组成和作用机理 3、课题重点：凝胶色谱法的原理和方法 4、课题难点： 样品的处理 色谱柱填料的处理和色谱柱的装填。,1、凝胶色谱法 也称为分配色谱法，是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。,一、基本概念及原理,什么是凝胶？,一些微小的多孔球体,大多是由多糖类化合物构成的，如葡聚糖、琼脂糖， 内含许多贯穿的通道， 具多孔的凝胶就叫分子筛,原理：,当不同的蛋白质通过凝胶时,相对分子质量较小,相对分子质量较大,凝胶内部的通道,容易进入,无法进入凝胶内部的通道,只能在凝胶外部移动,路程较长 移动速度较慢,路程较短 移动速度较快,相对分子质量

3、不同的蛋白质因此得以分离。,凝胶色谱法分离蛋白质过程的动画演示,练习1：用凝胶色谱法分离蛋白质时，分子量大的蛋白质（ ） A路程较长，移动速度较慢 B路程较长，移动速度较快 C路程较短，移动速度较慢 D路程较短，移动速度较快,D,练习2：相对分子质量不同的蛋白质在凝胶中的进行过程可表示为图中哪一个（ ）,B,1、概念：在一定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液PH发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。,2、作用： 能够抵制（ ）的对溶液的（ ）的影响，维持PH基本不变。,外界的酸或碱,PH值,二、缓冲溶液,3、缓冲溶液的配制,通常由（ ）种缓冲剂溶解

4、于水中配制而成。调节缓冲剂的（ ）就可以制得（ ）使用的缓冲液。,12,使用比例,在不同PH范围内,思考：说出人体血液中缓冲对。,NaH2PO4 / Na2HPO4,H2CO3 / NaHCO3,思考：在血红蛋白整个实验室中用的缓冲液是什么？它的目的是什么？,使用的是磷酸缓冲液，目的是利用缓冲液模拟细胞内的PH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察（红色）和材料的科学研究（活性）,三、 电泳-血红蛋白的分离鉴定方法,1.概念：,带电粒子在 作用下发生 的过程。,2.原理：,许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有 的基团，在一定的PH下，这些基团会带上 或 。 在电场的作用下，这些带电

5、分子会向着 的电极移动。 电泳利用了待分离样品中各种分子 以及分子本身的 、 的不同，使带电分子产生不同的 ，从而实现样品中各种分子的分离。,电场,迁移,可解离,正电,负电,与其所带电荷相反,带电性质的差异,大小,形状,迁移速度,待分离样品中各种分子,带电性质的差异,大小、形状的不同,带电分子产生不同的迁移速度,影响蛋白质分子运动速度的因素,在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。,最常用的电泳支持介质是聚丙烯酰胺和琼脂糖凝胶。 琼脂糖有一个相对较大的孔径，用来分离大分子例如核酸、大蛋白和蛋白复合物； 聚丙烯酰胺形成孔径较小的胶，适合于分离大多数蛋白和小片段核酸。,3.类

6、型:,琼脂糖凝胶电泳、聚丙稀酰胺凝胶电泳。,操作简单，电泳速度快，样品不需要事先处理；电泳后区带易染色，样品极易洗脱，便于定量测定。,（1）琼脂糖凝胶电泳,蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于 等因素。,它所带静电荷的多少以及分子的大小,SDS能与各种蛋白质形成蛋白质-SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于（ ）。,分子的大小,（2）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,练习1：有关凝胶色谱法和电泳法的说法正确的是 ( ) A.它们都是分离蛋白质的重要方法 B.它们的原理相同 C.使用凝胶色谱法需要使用缓冲溶液而电泳

7、不需要 D.以上说法都正确,A,练习2：使用SDS-聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋白质的电泳迁移率完全取决于 （ ） A 电荷的多少 B 分子的大小 C 肽链的多少 D 分子形状的差异,B,二、实验步骤,蛋白质的提取和分离一般分为四步：,样品处理粗分离纯化纯度鉴定（电泳）,实验操作,样品处理,（一）蛋白质提取和分离步骤,（二）操作过程,红细胞的洗涤,粗分离：,血红蛋白的释放,分离血红蛋白溶液,纯化：,纯度鉴定,透析去除样品中分子量较小的杂质,用凝胶色谱法除去相对分子质量较大的杂质,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,2. 血液有哪些成分？,1. 用鸡的红细胞提取DNA，用哺乳动物的红细胞提取血红蛋白的原

8、因是什么？,鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的提取；人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富，便于提取血红蛋白。,血红蛋白,每个肽链环绕一个亚铁血红素基团，此基团可携带一分子氧或一分子二氧化碳，血红蛋白因含有血红素而呈红色。,血红蛋白的特点：,采集得到血液（加入抗凝血剂柠檬酸钠）,洗涤过程：,血液 100mL,重复洗涤3次，直至上清液没有黄色,1、样品的处理 （1）红细胞的洗涤,（1）红细胞的洗涤 A.洗涤目的: ； B.分离时采用 离心，用 洗涤，重复洗涤 ，直至 ， 。 C、能否用蒸馏水代替生理盐水？,去除杂质血浆蛋白，以利于后续步骤的分离纯化,低速短时间,五倍体积的

9、生理盐水,三次,上清液不再呈现黄色 表明红细胞已洗涤干净,不能，生理盐水能保持红细胞的渗透压而不至于破裂，若红细胞提前破裂，使血红蛋白与杂质血浆蛋白混在一起，加大分离难度。,初次离心后的结果,3次洗涤后的结果,（2）血红蛋白的释放,思考： 释放血红蛋白过程中，在洗涤好的红细胞加入了哪些物质？ 为了加速释放过程，采取了什么措施？ （使用磁力搅拌器充分搅拌）,目的分析： 蒸馏水的作用是_。 加入甲苯的作用是_。 充分搅拌的目的是_。,使红细胞大量吸水涨破,溶解红细胞的细胞膜,加速红细胞的破裂,磁力搅拌器,搅拌器转子,搅拌器正在工作,分离过程,红细胞 混合液,烧杯,有机溶剂 血红蛋白,（3）分离血红

10、蛋白溶液：,第1层（最上层）：甲苯层（无色透明）,第2层（中上层）：脂溶性物质沉淀层（白色薄层固体）,第3层（中下层）：血红蛋白的水溶液层（红色透明液体）,第4层（最下层）：杂质沉淀层（暗红色）,试管中溶液层次,分离：用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。,柜式离心机,2.粗分离-透析（去除分子量较小的杂质）,（1）用 方法进行粗分离，透析袋由半透膜制成，常用 。将透析袋放入 溶液中进行透析。 （2）透析的原理是： （3）透析的目的是：,透析,玻璃纸、肠衣、膀胱膜,透析袋能使小分子自由进出，而将大分子保留在袋内,去除样品中分子量较小的杂质,磷酸缓冲,透析

11、血红蛋白,透析过程动画演示,3、纯化（凝胶色谱）-去除相对分子量较大的杂质蛋白,（1）凝胶色谱柱的制作： 取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。 底塞的制作：打孔挖出凹穴安装移液管头部覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好，插到玻璃管的一端。 顶塞的制作：打孔安装玻璃管。 组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体。 安装其他附属结构。,凝胶色谱柱的制作,（2）凝胶色谱柱的装填,凝胶的选择：A、材料：交联葡聚糖凝胶（G-75）。 凝胶的前处理：配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。 凝胶色谱柱的装填方法： A、固定：将色谱柱装置固定

12、在支架上。 B、装填：将凝胶悬浮液一次性缓慢倒入色谱柱 内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。 注意：1、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。 2、装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。,教材P70：为什么凝胶的装填要紧密、均匀？,如果装填不够紧密、均匀，就会在色谱柱内形成无效的空隙，使本该进入凝胶内部的样品分子从这些空隙中通过，搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，影响分离的效果。,思考,装配好的凝胶柱,(3）样品加入与洗脱,加样前,打开下端出口，使柱内凝胶面上的（ ）缓慢下降到与（ ）平齐，关闭出口,缓冲液,凝胶面,注意：正确的加样操作是：

13、1、不要触及并破坏凝胶面。2、贴壁加样。3、使吸管管口沿管壁环绕移动。,加透析样品,样品加入与洗脱：,调节缓冲液面：打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。 滴加透析样品：吸管吸1ml样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。 样品渗入凝胶床：加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。 洗脱：小心加入pH=7.0 的20mmol/l的磷酸缓冲液到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。 收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5ml收集一试管，连续收集。,色谱柱制作

14、成功的标志： 红色区带均匀一致的移动,4、纯度鉴定（电泳）：SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 （1）垂直板电泳装置 （2）稳流稳压电泳仪； （3）微量进样器（可用微量移液器代替）,（4）装槽、点样：,拔出梳子 将胶板固定在电泳槽上（凹板一侧向内） 在电泳槽中加入缓冲液 点样。,（5）电泳：,（6）剥胶、染色及脱色 凝胶板剥离：电泳结束后，撬开玻璃板，将凝胶板做好标记后放在大培养皿内，加染色液染色，然后用脱色液脱色。,（7）结果,思考下面的问题：,让血红蛋白处在稳定的pH范围内，维持结构和功能正常。,1、在血红蛋白纯化的整个过程中不断用磷酸缓冲液 处理的目的是什么？,2、与其他蛋白质相比，血红蛋白有什么

15、特点？这一特点对你进行血红蛋白的分离有什么启示？,血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。,3、你能描述血红蛋白分离的完整过程吗？,血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包括：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、分离血红蛋白溶液（离心）等操作收集到血红蛋白溶液，即:样品的处理；再经过透析去除分子量较小的杂质，即样品的粗分离；然后通过凝胶色谱法将相对分子质量较大的杂质蛋白除去，即:样品的纯化；最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。,(1)血红蛋白是人和其他脊椎动物红

16、细胞的主要组成成分，其在红细胞中的作用体现了蛋白质具有_功能。 (2)甲装置中，B是血红蛋白溶液，则A是_；乙装置中，C溶液的作用是_。 (3)甲装置用于_ ，目的是_。用乙装置分离蛋白质的方法叫_，是根据_分离蛋白质的有效方法。 (4)用乙装置分离血红蛋白时，待_时，用试管收集流出液，每5 mL收集一管，连续收集。,运输,磷酸缓冲液,洗脱血红蛋白,透析(粗分离),去除样品中相对分子质量较小的杂质,凝胶色谱法,相对分子质量的大小,红色的蛋白质接近色谱柱底端,练习：如图表示血红蛋白提取和分离的部分实验装置，请回答下列问题：,观察你处理的血液样品离心后是否分层（见教科书图5-18），如果分层不明显

17、，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。,三、实验结果分析与评价,1、你是否完成了对血液样品的处理？你能描述处理后的样品发生了哪些变化吗？,2、你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你的色谱柱装填得成功吗？你是如何判断的？,由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。此外，还可以加入大分子的有色物质，例如蓝色葡聚糖2000或红色葡聚糖，观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。如果色谱柱出现纹路或是气泡

18、，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。,如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。,3、你能观察到蛋白质的分离过程中红色区带的移动吗？请描述红色区带的移动情况，并据此判断分离效果？,教学反馈,1凝胶色谱法是根据（ ）分离蛋白质的有效方法。 A分子的大小 B相对分子质量的大小 C带电荷的多少 D溶解度 2缓冲液的作用是：在一定范围内，抵制外界的影响来维持（ ）基本不变。 A温度 B pH C渗透压 D氧气浓度 3电泳是指带电粒子在电场的作

19、用下向着与其所带电荷（ ）的电极移动。 A相同 B相反 C相对 D相向 4. 哺乳动物和人的成熟的红细胞中的（ ）与氧气的运输有关。 A血红蛋白 B肌红蛋白 C肌动蛋白 D肌球蛋白,B,B,B,A,5血液由血浆和各种血细胞组成，其中（ ）的含量最多。 A白细胞 B血小板 C红细胞 D淋巴细胞 6为防止血液凝固，在采血容器中要预先加入抗凝血剂（ ）。 A. NaCl B.甲苯 C.蒸馏水 D.柠檬酸钠 7将搅拌好的混合液转移到离心管中，离心后，可以明显看到试管中的溶液分为4层， 其中第3层是（ ） A无色透明的甲苯层 B脂溶性物质的沉淀层 C血红蛋白的水溶液 D其他杂质的暗红色沉淀物,C,D,C

20、,1、随着人类跨入蛋白质组时代，对蛋白质的研究和应用越来越深入，首先要做的一步是 A 弄清各种蛋白质的空间结构 B 弄清各种蛋白质的功能 C 弄清各种蛋白质的合成过程 D 获得高纯度的蛋白质,2、用凝胶色谱法分离蛋白质的过程中，关于蛋白质的叙述，正确的是 A 相对分子质量较小的蛋白质行程大于相对分子质量较大的蛋白质 B 相对分子质量较小的蛋白质行程小于相对分子质量较大的蛋白质 C 相对分子质量较小的蛋白质行程等于相对分子质量较大的蛋白质 D 二者根本无法比较,3、使用SDS-聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋白质的电泳迁移率完全取决于 A 电荷的多少 B 分子的大小 C 肽链的多少 D 分子形状的差

21、异 4、在采血容器中加入柠檬酸钠的目的是 A 调节pH B 维持红细胞的能量供应 C 防止微生物生长 D 防止血液凝固,1.答:凝胶色谱法也称为分配色谱法,它是根据分子量的大小分 离蛋白质的方法之一.所用的凝胶实际上是一些微小的多孔球体, 这些小球体大多数是由多糖类化合物构成,小球体内部有许多贯穿的通道,当一个含有各种分子的样品溶液缓慢流经时,各分子在色谱柱内进行两种不同的运动,即垂直向下的运动和无规则的扩散运动. 相对分子质量较大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒内部,只能分布在颗粒之间,通过的路程较短,移动速度较快;相对分子质量较小的蛋白质分子比较容易进入凝胶内的通道,通过的路程较长,移动速度较慢.因此,样品中相对分子质量较大的蛋白质先流出,相对分子质量中等的分子后流出,相对分子质量最小的分子最后流出,这种现象又叫分子筛现象.,1.凝胶色谱法分离蛋白质的的原理是怎样的?,课后练习,答:在一定范围内,能对抗外来少量强酸,强碱或稍加 稀释不引起溶液pH发生明显变化的作用叫做缓冲作用,