酶分子的修饰.ppt

1、第六章 酶分子的化学修饰,什么是酶分子修饰？,酶分子的化学修饰，就是在分子水平上对酶进行改造，以达到改构和改性的目的. 即在体外将酶分子通过人工的方法与一些化学基团(物质)，特别是具有生物相容性的物质，进行共价连接，从而改变酶的结构和性质。这种物质被称为修饰试剂。,酶具有稳定性差，活力不够高，以及可能具有抗原性等弱点使酶的应用受限制。因此人们希望通过酶分子修饰来改善这些弱点，来提高酶的使用范围和应用价值。,为什么要进行酶分子修饰？,酶分子修饰的意义,提高酶的活力 activity 增强酶的稳定性 stability 降低或消除酶的抗原性 immunological property 研究和了解

2、酶分子中主链、侧链、组成单位、金属离子和各种物理因素对酶分子空间构象的影响 structure,回本章目录,第一节 酶分子的修饰方法,酶分子的修饰： 酶的表面修饰 酶的内部修饰.,1.1 酶的表面修饰 1.1.1 化学固定化 一般是通过酶表面的酸性或碱性氨基酸残基将酶共价连接到惰性载体上，由于酶所处的环境的改变，会使酶的性质，特别是动力学性质发生改变,固定在电荷载体上，由于介质中的质子靠近载体，并与载体上的电荷发生作用，使酶的最适pH向碱性(阴离子载体)或向酸性(阳离子载体)方向偏移。因此在生产工艺中需几个酶协同作用时，由于固定化可使不同酶的最适pH彼此靠近。 如将糖化酶固定在阴离子载体上，其

3、最适pH由4.5升到6.5，与D-木糖异构酶的最适PH(7.5)靠近，这样可简化高果糖浆生产工艺。,1.1.2 酶的小分子修饰作用 用小分子修饰剂共价修饰酶，可使酶稳定性提高。这主要是利用一些适宜的小分子修饰剂来修饰酶表面的一些基团：COOH、一NH3+、SH、OH、咪唑基等。 如将胰凝乳蛋白酶表面的氨基修饰成亲水性更强的基团，酶的热稳定性在60时提高了1000倍，温度更高时稳定化效应更强烈。这个稳定的酶能经受灭菌的极端条件而不失活，因而有利于医疗用酶 马肝醇脱氢酶(HLADH)的Lys乙基化、糖基化和甲基化都能增加其活力。其中甲基化使酶活力增加最大，同时酶的稳定性也提高了。,1.1.3 酶的

4、大分子修饰 分为大分子非共价修饰和大分子共价修饰两类 （1）大分子的非共价修饰 使用一些能与酶非共价地相互作用而又能有效地保护酶的一些添加物，如聚乙二醇、右旋糖苷等它们既能通过氢键固定在酶分子表面，也能通过氢键有效地与外部水相连，从而保护酶的活力。 一些添加物，如多元醇、多糖、多聚氨基酸、多胺等能通过调节酶的微环境来保护酶的活力。有些来自嗜热菌的酶具有较高稳定性，其原因正是由于保护性大分子(如肽和聚胺)发挥作用的结果。 另一类添加物就是蛋白质。蛋白质分子之间相互作用时，其表面区域内排除了水分子，降低了介电常数，因而增加了相互作用力，其稳定性也就增加。因此酶的多聚体或酶聚合体的活力和稳定性比单体

5、高,（2）大分子共价修饰 利用水溶性大分子与酶结合使酶的空间结构发生某些精细改变，从而改变酶的特性与功能的方法称为大分子结合修饰法，简称大分子结合法。 用可溶性大分子，如聚乙二醇、右旋糖苷、葡萄糖、环状糊精、肝素、蔗糖聚合物、羧甲基纤维素、聚氨基酸等，通过共价键连接于酶分子的表面、形成一层覆盖层。 这些大分子修饰剂在使用前一般需经过活化，然后在一定条件下与酶分子中的侧链基团以共价键结合对酶分子进行修饰。,大分子共价修饰后的这种可溶性酶有许多有用的性质：如用聚乙二醇修饰超氧物歧化酶(SOD)，不仅降低或消除酶的抗原性，且提高了稳定性，抗蛋白酶的能力，延长了酶在体内的半衰期，从而提高了酶药效。 日

6、本学者将聚乙二醇连到脂肪酶、胰凝乳蛋白酶上所得产物溶于有机溶剂，在有机溶剂存在下能够有效地起作用。嗜热菌蛋白酶在水介质中通常催化肽链裂解，但用聚乙二醇共价修饰后，其催化活性显著改变，在有机溶剂中催化肽键合成，已用于制造合成甜味剂。,右旋糖酐经高碘酸活化后，酶上氨基共价结合形成修饰酶。,右旋糖酐的活化：,大分子结合修饰后的酶，呈现出来的催化特性： （1）通过修饰提高酶活力 （2）通过修饰增加酶的稳定性 （3）通过修饰降低或消除抗原性,1.1.5 脂质体包裹 酶脂质体包埋，能使一些被包埋的大分子的酶进入细胞内。 许多医药酶，如SOD、溶菌酶等，由于分子量大，不易进入细胞内，且在体内半衰期短，产生免

7、疫原性反应。为此，可通过酶的表面化学修饰来解决，如SOD用聚乙二醇(PEG)修饰，修饰后其在体内的稳定件及免疫原性都大大改善。但如何让修饰后的SOD进入细胞内？可以采用脂质体包裹的方法。,脂质体是天然脂类和或类固醇组成的微球体。酶分子可包埋在其内部。它可通过与细胞的膜融合或内吞作用而进入细胞内。 脂质体无毒、易制作，亦被用作基因载体。把经过表面修饰的SOD包埋在脂质体中便可进入细胞。Michelsonn发现，被包装的SOD进入细胞的能力比非脂质体大得多，但包装后的SOD进入胞内能力与脂质体成分及电荷特性有关。,酶的大分子修饰总结,使用一些能与酶非共价地相互作用而又能有效地保护酶的一些添加物，如

8、聚乙二醇、右旋糖苷等，它们既能通过氢键固定在酶分子表面，也能通过氢键有效地与外部水相连，从而保护酶的活力。 一些添加物，如多元醇、多糖、多聚氨基酸、多胺等能通过调节酶的微环境来保护酶的活力。 另一类添加物就是蛋白质。蛋白质分子之间相互作用时，其表面区域内排除了水分子，因而增加了相互作用力，其稳定性也就增加了。,非共价修饰,用可溶性大分子，如聚乙二醇、右旋糖苷、肝素等，通过共价键连接于酶分子的表面，形成一层覆盖层。 例如：用聚乙二醇修饰超氧物歧化酶 ，不仅可以降低或消除酶的抗原性，而且提高了抗蛋白酶的能力，延长了酶在体内的半衰期从而提高了酶药效。 每分子核糖核酸酶与6.5分子的右旋糖酐结合，可以

9、使酶活力提高到原有酶活力的2.25倍； 每分子胰凝乳蛋白酶与11分子右旋糖酐结合，酶活力达到原有酶活力的5.1倍,共价修饰,聚乙二醇是线性分子具有良好的生物相容性和水溶性，在体内无毒性、无残留、无免疫原性，并可消除酶的抗原性，使其末端活化后可以与酶产生交联，因而，它被广泛用于酶的修饰。,此外，还有脂质体包裹、反相胶团微囊化等修饰方法,1.2 酶分子内部的修饰 1.2.1非催化活性基团的修饰 用化学试剂与酶蛋白上的非催化活性基团部位的一些氨基酸残基进行共价连接进行修饰的方法。 被修饰的残基可以是亲核的(Ser、Cys、Met、Thr、Lys、His)，也可以是亲电的(Tyr、Trp)还可以是可氧

10、化的(Tyr、Trp、Met)。 对这类非催化残基的修饰可改变酶的动力学性质，改变酶对特殊底物的束缚能力。,1.2.2 催化活性基团的修饰 通过有目的、选择性修饰侧链成分来实现催化活性基团部位内的氨基酸的取代，这种将氨基酸侧链转化为另一种新的氨基酸侧链的方法，叫化学突变法。 如将枯草杆菌蛋白酶活性部位的Ser残基转化为Cys残基，新产生的巯基蛋白酶对肽或脂没有水解能力，但能水解一些高度活化的底物，如硝基苯脂。这种方法由于受到专一试剂、有机化学工业水平的限制，没有蛋白质工程技术普遍，但它通过产生非蛋白质氨基酸的能力，可以有力地补充蛋白质工程技术。,1.2 酶分子内部的修饰 1.2.3 酶蛋白主链

11、修饰 酶蛋白主链修饰主要是靠酶法对酶蛋白的主链进行相关修饰。 如用蛋白酶对ATP酶有限水解，切除其十几个残基后，酶活力提高了5.5倍。该活化酶仍为四聚体，亚单位分子量变化不大。这说明天然酶平时处于非最佳的催化构象状态。,1.3.2 酶的金属离子置换修饰,把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子，使酶的特性和功能发生改变的修饰方法，称为金属离子置换修饰。 酶分子中的金属离子取代可以改变酶的专一性、稳定性及其抑制作用。 -淀粉酶中的钙离子（Ca2+），谷氨酸脱氢酶中的锌离子(Zn2+)，过氧化氢酶分子中的铁离子(Fe2+)，酰基氨基酸酶分子中的锌离子（Zn2+）,超氧化物歧化酶分子中的铜、锌离子(C

12、u2+,Zn2+),1.3.2 酶的金属离子置换修饰,若从酶分子中除去其所含的金属离子，酶往往会丧失其催化活性。如果重新加入原有的金属离子，酶的催化活性可以恢复或者部分恢复。 若用另一种金属离子进行置换，则可使酶呈现出不同的特性。有的可以使酶的活性降低甚至丧失，有的可以使酶的活力提高或者增加酶的稳定性。,金属离子置换修饰的过程,酶的分离纯化：首先将欲进行修饰的酶经分离纯化，除去杂质，获得具有一定纯度的酶液。 b. 除去原有的金属离子：在纯化的酶液中加入一定量金属螯合剂，如乙二胺四乙酸（EDTA）等，使酶分子中的金属离子与EDTA等形成螯合物。通过透析、超滤、分子筛层析等方法，将EDTA-金属螯

13、合物从酶液中除去。此时酶往往成为无活性状态。 c. 加入置换离子：去离子的酶液中加入一定量另一种金属离子，酶蛋白与新加入的金属离子结合，除去多余的置换离子，就可得到经过金属离子置换后的酶。,金属离子置换修饰的注意事项,金属离子置换修饰只适用于那些在分子结构中本来含有金属离子的酶。 用于金属离子置换修饰的金属离子，一般都是二价金属离子。,金属酶的金属取代举例 如酰化氨基酸水解酶活性部位中的Zn2+被Co2+取代后的酶，其最适pH和底物专一性都有改变：Zn酶对乙酰Ala的最适pH8.5而Co酶为7.0；钴酶对N氯乙酰Ala等6种底物的水解活力增加，而对N氯乙酰Met等三种底物的活力降低。在使用时对

14、不同底物可以选用不同的酶Zn/Co酶。 FeSOD中的Fe被Mn取代后，酶的稳定性和抑制作用发生显著改变：Mn-SOD对H2O2稳定性显著增加而对NaN3的抑制作用显著降低。,第二节 酶侧链基团的修饰,酶化学修饰的目的，主要是提高酶的稳定性和消除作为外源物质在体内的抗原性。要达到这些目的，在修饰原理、修饰剂和反应条件的选择以及对酶学性质的了解等方面，都必须有足够的了解。,2.1被修饰酶的性质 在开展酶的修饰工作前对被修饰酶的酶学性质必须有一个较为全面的了解。 2.1.1 酶的稳定性 被修饰酶对热、对酸碱的稳定性，作用温度及PH范围以及最适温度、最适PH的情况等应有所了解。 2.1.2 酶活性中

15、心的状况 酶催化活性主要依赖于酶的活性中心。因此对酶活性中心的组成，如：酶蛋白中哪些氨基酸残基或其侧链基团参与了酶活性中心是否需要辅因子，此外还需了解酶分子形状、寡聚酶的亚基组成等。,2.1.3 酶侧链基团的性质及反应性 选择性修饰试剂必须要与多肽链中某一种特定的氨基酸残基侧链基团发生化学反应，并形成紧密共价结合。 酶分子中经常被修饰的氨基酸残基侧链基团有：巯基、氨基、羧基、咪唑基、羟基、酚基、胍基、吲哚基、硫醚基及二硫键等。,2.1.3 酶侧链基团的性质及反应性 （1）对巯基的化学修饰 巯基是蛋白质的一类重要的亲核基团，因此常被用来修饰。修饰方法大体上有如下几种： 烷基化试剂。烷基试剂中用得

16、最多的是碘乙酸、巯基乙醇、谷胱甘肽(GSH)、碘乙酰胺。 ESH+ICH2COOH ESCH2COOH 汞试剂。这类试剂如HgCl2、对氯汞苯甲酸(pCMB)和2氯汞硝基苯酚等。,Ellman试剂。5，5二硫-二-（2硝基苯甲酸)是目前最常用的巯基修饰试剂，又称Ellman试剂，还可用来测定酶蛋白巯基含量。,(2)氨基的化学修饰 乙酸酐修饰,2，4，6三硝基苯磺酸修饰。,2，4二硝基氟苯修饰(Sanger反应) Sanger反应的作用？,氨基的烷基化。这类试剂包括卤代乙酸、芳香卤和芳香磺酸等。,丹磺酰氯(DNS)修饰。,苯异硫氰酸酯(PITC)修饰(即Edman反应),(3)羧基的化学修饰 (

17、4)咪唑基的修饰反应。 (5)吲哚基的化学修饰 甲硫氨酸侧链基团的化学修饰 胍基的化学修饰,(8) 二硫键的化学修饰,2巯基乙醇修饰,二硫苏糖醇(DTT)修饰,（9）酚基的化学修饰,N乙酰咪唑修饰,碘化反应,2.2 酶分子修饰的基本要求和条件,对酶分子进行修饰必须在修饰原理、修饰剂和反应条件的选择以及酶学性质等方面都要有足够的了解。 做好基础课 （1）酶的稳定性 热稳定性、酸碱稳定性、作用温度、pH、抑制剂等。 （2）酶活性中心的状况 活性中心基团、辅因子等。其他如分子大小、性状、亚基数等。,酶分子修饰的条件,修饰反应尽可能在酶稳定条件下进行，并尽量不破坏酶活性功能的必需基团，使修饰率高，同时

18、酶的活力回收高。 （1）pH与离子强度 pH决定了酶蛋白分子中反应基团的解离状态。由于它们的解离状态不同，反应性能也不同。 （2）修饰反应的温度与时间 严格控制温度和时间可以减少以至消除一些非专一性的修饰反应。 （3）反应体系中酶与修饰剂的比例,回本章目录,因此谨慎选择修饰反应条件是必须的。当然，这些修饰条件随着修饰反应的不同而不同，因此，需要经过大量实验摸索才能确定.,2.2.1 pH与离子强度 pH决定了酶蛋白分子中反应基团的解离状态。由于它们的解离状态不同，反应性能也不同。 例如在pH25时，碘乙酸可以选择性地与Met的侧链基团发生修饰反应，而在此pH条件下，可被碘乙酸修饰的基团，如巯基

19、、咪唑基和氨基等，都处于不反应的状态。 另一方面，有些修饰试剂在不同pH条件下与同一基团可形成不同产物。,2.2.2 修饰反应的温度与时间 严格控制温度和时间可以减少以至消除一些非专一性的修饰反应。 如用聚乳糖作修饰剂表面修饰酶（还原剂为氢硼化氰，BH3 CN）时在8时10d内几乎无反应而当温度从25上升到37时反应速度加快了3倍，而且随pH的升高而加快。 用甲酸氧化酶蛋白的反应，在低温(约10)下修饰反应仅限于Cys、胱氨酸和Met残基上，而在较高温度下，甲酸可以与Trp、Tyr、Ser、 Scr以及Thr残基发生反应。 2.2.3 反应体系中酶与修饰剂的比例 用聚乙二醇(PEG)修饰酶时，

20、活化PEG的多少能控制酶分子的修饰程度。,2.3 酶蛋白修饰反应的主要类型 化学修饰剂与酶蛋白反应的类型主要有如下几种： 2.3.1 酯化及相关反应 酯化及相关反应，主要的修饰试剂包括乙酰眯唑、二异丙基氟磷酸(DFPA)、酸酐磺酰氯、硫代三氟乙酸乙酯、O甲基异脲。 在室温(2025)、pH4.59.0条件下，主要与酶蛋白中的氨基、羟基、酚基及巯基等侧链基团发生酰基化反应：,2.3.2 烷基化反应 这类修饰剂主要有2，4二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺、碘甲烷、苯甲酰卤代物等，通常带有一个活泼的负电性的卤素原子，使烷基带有部分正电性，导致酶蛋白亲核基团烷基化。常被修饰的基团有氨基、巯基、羧基、甲硫基

21、、咪唑基等。,2.3.3 氧化还原反应 氧化剂有H2O2、N溴代琥珀酰亚胺等；另外一类是光氧化试剂。它们都具有氧化性，能将侧链基团氧化。受氧化的侧链基团有巯基、甲硫基、吲哚基和酚基等。 还原剂有2巯基乙醇、巯基乙酸、二硫苏糖醇(DTT)等。它们主要作用于二硫键。 连四硫酸钠、连四硫酸钾作为氧化剂作用温和，同时，在修饰反应中用作巯基保护剂。例如：,2.3.4 芳香环取代反应 四硝基甲烷(TetranitroMethane，TNM)反应 ： 由于蛋白质中氨基酸残基上的酚羟基在3和5位上容易发生亲电取代的碘化和硝代反应，其中四硝基甲烷是这类修饰剂中的典型例子四硝基甲烷作用于Tyr残基的酚羟基后，形成

22、3硝基酪氨酸衍生物。其产物具有特殊光谱。,2.3.5 溴化氰BrCN)裂解反应 BrCN裂解Met反应可在自发诱导重排条件下导致肽键断裂：,第三节 酶蛋白肽链的修饰,酶蛋白肽链的修饰包括和肽链有限水解修饰和对酶蛋白肽链的大分子修饰反应，耍注意的问题是修饰剂分子量大小、链的长度。一般要求修饰剂具有较大的分子量、良好的生物相容性和水溶性。这样，经修饰的酶，其半衰期较长，活力回收较高。下面将介绍些主要的修饰反应和修饰剂。,酶蛋白主链修饰(肽链有限水解修饰),利用酶分子主链的切断和连接，使酶分子的化学结构 及其空间结构发生某些改变，从而改变酶的特性和功 能的方法。 酶蛋白主链修饰之一主要是靠酶切/酶原

23、激活法。,a、胃蛋白酶原的激活,b、胰蛋白酶原（trypsinogen）的激活,c、胰凝乳蛋白酶原（chymotrypsinogen）的激活,肽链有限水解修饰 酶蛋白主链修饰 酶切 / 酶原激活法 胰凝乳蛋白酶原（chymotrypsinogen）的激活,3.1 聚乙二醇及其修饰反应,聚乙二醇（PEG）具有良好的生物相容性和水溶性，在体内无毒性、无残留、无免疫原性，并可消除酶的抗原性使其末端活化后可以与酶产生交联，因而，它被广泛用于酶的修饰。 被修饰的酶分子被盖上一层疏松的亲水外壳，导致流体动力学发生改变，从而产生了许多有用的性质，比如：修饰酶能在广泛的pH范围溶解；不被离子交换剂吸附；电泳迁

24、移率下降；沉降速度较天然酶慢等。 聚乙二醇用作修饰剂时应注意下面几个问题：,(1)PEG分子量为750一5000的修饰效果较好，用甲氧基PEG效果更好。 (2)修饰效果不仅与其分子量有关，还与所用活化剂及其与酶的配比有关。般活化PEG与酶的配比为1550：1（mol)时，酶活性最多保留40以上。 (3)在多数情况下酶的抗原性随分子表面自由氨基被其修饰而降低，当50以下自由氨基被修饰后，酶基本没有抗原性了，但酶活性也随自由氨基的减少而下降，因此在选择方法上，应尽量选择对酶活性影响小的修饰方法。 PEG的修饰方法主要有以下几种。,3.1.1 叠氮法 此法是将PEG末端羟基转化为叠氮基，然后与酶反应

25、。,（1)PEG甲氧甲酰甲酯制备，PEG与氯代醋酸酐及重氮甲烷反应，生成PEG甲氧甲酰甲酯，再与亚硝酸钠反应生成叠氮化合物而活化。,3.1.2 琥珀酸酐法 此法常用二溴代琥珀酸酐在温和的碱性条件下将PEG活化，经减压浓缩制得活化PEG，活化PEG与酶分子上氨基发生交联反应，而得修饰酶：,3.1.3三氯均嗪法 PEG经三氯氯均嗪活化后，用石油醚抽提或减压蒸馏，制得活化PEG，后者与酶交联，制得修饰酶：,3.1.4羰二亚胺法 此法是将PEG用无水三乙胺、对磺酰氯甲苯处理后，再加NaN3沸腾回流处理36h制得PEGN3，PEGN3再转变成PEGNH2，PEGNH2通过羰二亚胺与酶分子上羧基交联：,3

26、.1.5 重氮 法 此法是将PEG末端羟基转化为重氮基团，再在弱碱性条件下与酶分子的酚基、咪唑基等反应，而生成修饰酶。主要反应有以下三种。 (1)对硝基苄基氯活化法,(2)N羧甲氨基苯甲酐活化法,(3)4氟2硝基重氮物活化法,3.2 糖类的修饰反应,3.2.1 右旋糖苷及右旋糖苷硫酸酯的修饰反应 右旋糖苷是由葡萄糖通过1，6糖苷键连接而成的高分子多糖，具有良好的生物相容性和水溶性。其多糖上的双羟基经活化后可与酶分子上游离氨基相结合、从而修饰了酶。 （1）溴化氰法 （2）高碘酸氧化法,3.2 糖类的修饰反应,3.2.2糖肽(Glycopeptide)的修饰反应 糖肽是蛋白酶水解人纤维蛋白或Y一球

27、蛋白所得到的产物。其分子上具有游离氨基，活化后与酶分子上氨基反应，从而可修饰酶。 (1) 2，3异氰酸甲苯活化法 （2）戊二醛法 3.2.3 聚乳糖Polylactose)修饰反应,3.3 合成大分子多聚物修饰酶,3.3.1 聚N乙烯吡咯烷酮 PVP(N乙烯吡咯烷酮) 水溶性、分子量为10000，常用作修饰剂。,3.3.2聚乙烯醇修饰酶 聚乙烯醇（PVA）与对硝基苯氧酰氯反应后，其产物的硝基用连二亚硫酸钠还原成氨基，与酶分子中羧基共价连结，生成修饰酶。,3.3.3 聚丙烯酸(PAA)修饰酶 聚丙烯酸常用的分子量为250 000，经N羟基琥珀酰亚胺活化后与酶的氨基反应，生成修饰酶。其反应过程如下

28、：,3.3.4 聚氨基酸修饰酶 聚赖氨酸修饰酶 聚赖氨酸作为修饰剂的常用分子量为6700。其Lys上的氨基与含羧基较多的酶的羧基通过羰二亚胺产生交联，从而生成修饰酶。其反应如下：,3.4 天然大分子对酶的修饰反应,3.4.1 肝素修饰酶 肝素由氨基葡萄糖和两种糖醛酸组成，平均分子量约2000，是一种含硫酸酯的粘多糖：,经肝素修饰的酶具有良好的稳定性，同时具有抗凝血、抗血栓、降血脂等活性，更能提高酶的疗效。目前常用羰二亚胺、三氯均嗪、溴化氰活化法来用肝素修饰酶。现分别介绍如下： （1）羰二亚胺法 用羰二亚胺活化肝素分子上的羧基后，与酶上的氨基共价连接，形成修饰酶：,（2）三氯均嗪法 肝素分子的羟

29、基用三氯均嗪活化后，与酶分子上的氨基反应，形成修饰酶。,（3）溴化氰法 肝素的邻双羟基用BrCN活化，然后与酶的氨基反应生成修饰酶。其反应与右旋糖苷溴化氰活化法相似。,3.4.2 人血清白蛋白修饰酶 (1) 戊二醛法 利用戊二醛双功能基团使白蛋白上的和酶分子上的氨基相互交联，从而生成修饰酶。,（2）羰二亚胺法 利用羰二亚胺作交联剂，使白蛋白与酶交联起来，从而生成修饰酶。反应如下：,(3) 活性酯法 目前活性酯法应用较多，酶的修饰程度高，活力回收高，同时不需用底物保护。其反应过程如下：,第四节 修饰酶的性质,酶分子化学修饰这项新技术可以大大地改善天然酶的不足之处，使其更适合于工业生产的应用要求。

30、如修饰酶稳定性的提高，便导致其应用工艺上降低成本、改善反应条件及延长使用寿命，最终导致了工业上的技术革新和技术改造。 酶的化学修饰改变了天然酶的最适pH、Km、抑制常数、减少或消除了抗原性，甚至使酶分子具备对某些组织和细胞的亲和力和穿透性。这些性质也正是酶应用技术中的关键问题。因此酶化学修饰后酶性质改变的研究，在工业生产和基础理论上都具有十分重要的意义。,4.1 修饰酶的热稳定性 酶分子经化学修饰后，一般热稳定性有较大的提高。这是由于修饰剂的多个功能基团与酶分子上的多个基团（如氨基、羧基、咪唑基、酚基、巯基等）相互交联，增加酶分于构象稳定性，因而提高了酶对热的稳定性。PEG修饰酶的稳定性没有明

31、显提高，可能是因为这种交联作用较少之故。 但这种交联如果发生在酶分子活性中心，不但酶的活力会下降，而且有时酶的热稳定性也有下降的现象。,4.2 修饰酶的抗原性 修饰酶的抗原性与修饰剂有关。目前，比较公认的在消除酶的抗原性上效果比较明显的是PEG和人血清白蛋白。 PVP (N乙烯吡咯烷酮)修饰的酶，在重复用于体内后，会诱导机体产生抗体而使酶失活。糖类物质包括右旋糖苷也不容易消除酶的抗原性，在体内仍可诱发过敏反应。,4.3 修饰酶对各类失活因子的抵抗力 下表列举了多种修饰酶对蛋白酶和各类相应抑制剂的抵抗能力。可以看修饰酶对蛋白酶、抑制剂均有一定的抵抗能力，从而提高其稳定性。,4.4 修饰酶在体内的半衰期 修饰酶与天然酶比较，一般在体内半哀期得到有效延长。由于酶分子经修饰后，增强了对热、蛋白酶、抑制剂等的稳定性，因此就延长了在体内的半衰期。这对酶的应用十分有利。,4.5 最适pH 大部分酶经化学修饰后，酶的最适pH发生变化。这种变化在应用上有时具有重要意义。如猪肝尿酸酶用白蛋白修饰后，最适pH由天然酶的10.5，下降到7.48.5。这一变化使pH下降了2个多pH单位，同时pH范围也扩大。修饰的最适pH更接