生皮组织学实验.ppt

1、生皮组织学实验,组织学(histology)：研究机体微细结构及其相关功能的科学。以显微镜观察组织切片为基本方法，又称显微解剖学 (microanatomy),组织切片技术是将生物组织切成很薄的切片（525um），再用不同的方法染色，在显微镜下显示出不同细胞和组织的形态。在医学领域中，有着极为重要的作用。,通过组织切片能比较直观地观察皮革的组织结构情况，因此用组织学方法研究各种原料皮的组织结构、研究和检查在生产过程中的变化以及成革的质量都有着极其重要的作用,实验目的,掌握染色的原理及试验方法 了解试验常用设备 更好的了解生皮的组织结构,实验原理,嗜碱性：,细胞和组织中的酸性物质或结构（嗜碱性物

2、质）与碱性染料亲和力强。,嗜酸性：,细胞和组织中的碱性物质或结构（嗜酸性物质）与酸性染料亲和力强。,中性：,与两种染料的亲和力均不强。,生皮组织中不同的物质的酸碱性质不同，其与不同染色剂亲和力不同，经染色后表现出不同的颜色，而和其它部分区分开来,实验原理,媒染剂：有的天然染科染色能力较弱，但加入某些化学药品之后则可得到较好的染色效果,这种比学试剂叫做媒染剂，如：苏木精染色时加入钾盐，铁盐，铵盐可增强其染色能力；媒染剂本身要与染料和组织结合，从而增进染料染色能力。 助染剂：与媒染剂不同，不参与染色反应，只是增加染色能力，如在伊红中加少量冰醋酸就可增强染色能力,一、苏木精伊红染色（简称 H E 染

3、色） 苏木精(hematoxylin)： 蓝色，碱性染料，可使细胞核和胞质内的酸性物质或结构（嗜碱性物质:粗面内质网 、游离核糖体）着蓝紫色。 伊红(eosin)： 红色，酸性染料，可使细胞质、溶酶体等大多数细胞器，以及细胞间质内的胶原纤维等碱性物质或结构（嗜酸性物质）着红色。,实验原理,HE染色,苏木精,伊 红,嗜碱性结构： 细胞核 粗面内质网 游离核糖体等,嗜酸性结构： 细胞质基质 溶酶体、线粒体等细胞器 胶原纤维等,实验原理,实验原理,二、铁苏木染色法 威氏铁苏木染液 甲液：苏木素 1g 无水乙醇：100mL 乙液：29%三氯化铁 4mL 水：95mL 盐酸1mL 范氏染液 酸性品红,实

4、验原理,染色结果:胶原纤维呈红色，表皮、肌肉呈黄色，细胞核呈暗褐色。,三、威氏弹性纤维染色法 碱性品红 呈暗红色粉末或结晶状，能溶于水（溶解度1%）和酒精（溶解度8%）。可用来染色胶原纤维、弹性纤维、嗜复红性颗粒和中枢神经组织的核质。 染料配制 碱性品红 2g 间苯二酚 4g 蒸馏水 200mL,实验原理,染色结果:弹性纤维呈深蓝色，胶原纤维呈浅蓝色。,实验原理,四、苏丹IV染色法 苏丹染液 橙黄色脂肪染色剂 。 染料配制 苏丹 1g 70%酒精 50mL 丙酮 50mL,实验原理,染色结果:中性脂肪呈红色，脂肪酸呈蓝色,实验原理,镀银法显示神经细胞、嗜银颗粒 马氏三色法显示胰岛细胞 甲苯胺蓝

5、法显示糖胺多糖,实验原理,基本过程 取样固定(包埋)切片染色 封固显微镜观察,实验过程,取 样,考虑到原料皮的部位差，要在不同的部位取样 刀一定要锋利，避免挤压组织使之变形,实验过程,固 定,固定的目的 防止组织腐烂变质 尽可能地保持组织或观察目标原有形态 增加组织的硬度 使组织内各种物质产生不同程度的折光率、便于识别 起到助染作用,实验过程,固定的原理 沉淀作用：一些物质可以在固定剂的作用下发生沉淀。 变性作用：蛋白质变性后最明显的变化就是失去了可溶性，本身成为沉淀状态。例如酒精对蛋白质的变性作用 蛋白质凝胶化：固定液与蛋白质间起了化学上的结合，改变了分子结构，但不产生沉淀，而使蛋白质凝胶化

6、，且不溶于水,实验过程,固 定,常用固定剂 波音氏固定液： 饱和苦味酸水溶液 75mL 40%甲醛溶液 25mL 冰醋酸 5mL 10%甲醛溶液,40%甲醛溶液 100mL 磷醋二氢纳 4g 磷酸氢二钠 6.5g 蒸馏水 900mL,实验过程,固 定,固定剂的选择 固定剂的好坏，直接关系到能否制得好的切片，因此，必需选择适当的固定剂，在选择固定剂时要考虑下列几点： I. 能否沉淀或凝固蛋白质、脂肪，类脂或碳水化合物 2. 穿透组织的速度 3是否使组织膨胀或收缩 4对染色的影响。,实验过程,固 定,包 埋,包埋的目的 有些样品比如牦牛皮、羊皮等组织比较松软，在冰冻切片过程中极易破碎 给组织以某种

7、支撑，防止组织在切片和染色的过程中破碎,实验过程,包埋方法 1、明胶包埋： 10%明胶，37，24h- 25%明胶，37，24h- 25%明胶，冰箱冷凝 不经高温和有机溶剂的处理，组织变形小，脂肪等组织成分不会丢失。适用于原料皮及其加工过程中组织成分和组织结构的观察，也适用于观察成品革的缺陷和进行不同质量成品革的对比研究。缺点是有不少传统的染色方法无法或很难着色，切片不能切得太薄。如切片厚度小于12uM，易破碎,实验过程,包 埋,包埋方法 2、石蜡包埋： 须经5060的温度和有机溶剂的处理，皮组织的变形和收缩作用剧烈。有些组织成分如脂肪在包埋中会丢失，这对观察纤维形态的变化会产生根大的干扰。,

8、实验过程,包 埋,切 片,冰冻切片法 取出经固定的样品，冲洗，在冰冻切片机上切片，片厚一般为825um 明胶包埋切片法 石蜡包埋切片法,实验过程,切 片,实验过程,滑走式切片机,旋转式切片机,染 色,不同的染色方法染色也的配制及染色步骤不完全相同，具体的染色步骤见试验指导书 一般有下列基本步骤 附贴、染色、水洗、分化、脱水透明等,实验过程,分 化：组织经过染色后，需用适当的化学药品退去不需要上染的部分，以便使染料结合牢固的部分更为明显、清晰的显现出来，这一操作称为分化。 分化非常重要：分化步骤的准确也是染色成败的关键，若分化失当则必然引起染色不匀或过淡，过深等现象,实验过程,染 色,分化剂分类

9、： 酸类 它能使留在组织内的金属离子分离，并与之化合而形成可溶性的盐类，从而腿去一部分额色。比如：1%的盐酸酒精溶液 氧化分化剂 具有漂白作用，能把组织上所有的染料无选择地氧化为无色物质，但其作用速度较慢故可先将与组织中着色不牢固的部分氧化，而着色牢固部分则可保留必要的颜色，从而达到分化的日的。如：高铁氰化钾，高锰酸钾、重铬酸钾、苦味酸等,实验过程,染 色,分化剂分类： 媒染分化剂：媒染剂能促使组织和染色剂相结合。如果将已染色的切片再放到媒染剂的溶液中，则可使已经和组织相结合的染色剂脱去，这是媒染剂的另一种功能。从这个角度看，又可称之为“媒染分化剂”。它对组织既能使染料附着，又能脱去染料，二者

10、初看似乎矛盾，其实不然，这是因为染色剂和媒染剂的比例关系不同，当溶液中媒染剂的量超过了染色剂的量时，占有压倒优势的媒染剂就把已经和组织细胞相结合的染色剂夺取过来，使组织细胞脱色，即为分化现象。当然，含染料较少的组织必然先被脱色，而着色较浓的组织随着分化时间的控制，即可保留必要的颜色，从而达到分化的目的,实验过程,染 色,脱水与透明：除去不染色的切片及水溶性的封固剂封固的切外，其它各种非水溶性封固剂封固的切片，在染色、分化、水洗后均需脱水与透明。这是因为水的折射率比组织低得多，切片不够透明，显微镜观察模糊不清，且切片不能持久保存。常用的脱水剂为酒精，透明剂为二甲苯。,实验过程,染 色,封 固,常用封固剂： 1）水溶性封固剂 （甘油明胶液） 2）水不溶性封固剂 （中性树胶）,实验过程,封固：经过染色、脱水、透明之后进行封固，以便进行观察和使切片能住适当的封固剂中保存。理想的封固剂其折光率最好与组织相近似，这样既透明又清晰,实验过程,封固应注意的问题,实验过程,（1）浓度适中，以恰能滴下为珠状为好。太稀易于溢出玻片，且当溶剂挥发后，组织切片就会产生气泡。太浓则不易滴下，且在