血浆-血清-体液蛋白质组学.ppt

1、血浆、血清、体液蛋白质组学研究及其应用、1、蛋白质组学基本知识、2、血浆、血清蛋白质组学、唾液蛋白质组学、尿蛋白质组学、脑、脊液蛋白质组学、1、蛋白质组学基本知识、3、4、蛋白质组学(proteome=PP 研究细胞、组织或生物体蛋白质组成及其变化规律的科学， 5基本生物学问题post-translationalmodificationprotein-proteininteractiongenome-transcript ome-proteome临床应用问题disease marker-droteininteraction e Proteomics，6，蛋白质组学研究的基本技术，分离，Gel-

2、based，Liquid-based，HPLC，FFE，SCX，RP，SEC ESI-MS-MS，LC-ESI-MS-MS，计算机技术，7， IEF: isoelectric focusing (等电焦点)， 第二方向是根据分子量用SDS-PAGE分离，将复杂蛋白混合物中的蛋白质在二维平面上分离， HPLC:highperformanceliquidchromatographyorhighpressureliquidchromator dige:2 ddifferencegelectrophoresis，基本缩写，it raq : iso 离子源还可以是电子轰击源(EI )、化学离子化源(CI

3、 )场电话离子源(FI )、电喷雾离子化源(Electro Spray Ionization ) MS:Mass Spectroscopy (质谱)，MS/MS是串联四级棒质谱，在两个质谱仪之间的碰撞室进行一定能量的碰撞，选择性扫描碰撞后得到的子离子的碎片被丢弃，与一定质量数不符，背景基本缩写，9，ESI-ms :电子散射光谱，电子散射光谱，maldi-tof-ms:matrix-assistedlaserdesorptionionion timeofflightmassspectrometry基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱采用新型软件LC-ESI-MS/MS:高效液相色谱-电喷雾串联质谱，

4、 MALDI-TOF-TOF :基质辅助激光解吸离子化-串联飞行时间质谱，MALDI-Q-TOF :基质辅助激光解吸离子化-三PMF: Peptide Mass Fingerprinting (肽质量指纹光谱)， 蛋白质是由识别特异酶切点的蛋白酶水解而得到的肽片段的质谱，在蛋白质组学研究中，质谱测定一般利用串联质谱(MS/MS )测定，另一种利用源后衰变(PSD ) 基本缩写： IPG (ef ) :固相profound 3360 prowl.R，pep ident 3360 www.expasy.ch protein prospector : prospector

5、常用串联质谱检索工具，se quest : field.S/se quest，pep frag : prowl.R， 基于proteinprospectool 2DE的差异蛋白质组学技术流程， 14 providesahard-copyrecordofseparationallowsfacilequantitationseparationofupto 3000 differentproteinshighlyreproduciblegivesinn icationsinexpensive是limitedpirange (4-8)属性150 kdno

6、tseenin2dgelsdifficulttoseemembraneproteins (30 % of all属性) onlydetectshighabundanceproteins (顶级30 %类型)时间咨询30 % ofspotswithmultipleproteinsfrompi4- 7， 受到缺陷：标记效率低、Lys氨基的1%左右、2DE的分离能力被限制的蛋白质在2DE上的共移现象的影响，可能会影响复杂样品的isoform定量。 2 ddifferencegelectrophoresis (dige )，24，cyslabelingmodifybeforresis纯化含Cys肽段，

7、有效肽段损失大(达90% )。 ICAT对分子量大、小肽段影响数据库的检索。 2H、1H标记的肽段在反相分离时显示轻微的洗脱时间不一致现象，定量困难。 仅鉴定含有cys的肽段，降低了质谱分析的复杂性。 25、isobaric labeling : n-termlysmodifyafterdigestrequiresms/ms测量，优点：全标记，范围宽，灵敏度高于ICAT。 可以绝对定量。 缺点：需要MS/MS分析后进行定量的酶解后的标记样品仅适用于复杂度高的LC-MALDI-TOF/TOF或LC-MS/MS。it raq工作流程补充、26、themassdifferencebetweenlab

8、elled (12 c/13 c ) andunlabelledpeptidesare 105.0215 da/111.0419 daforeachmodifiedaminogroup 3360 lysproteinn-term.DM=6.0204 da/modlysresidue，优点：可进行包括蛋白水平标记、全标记NH2离子阱在内的所有质量分析。 缺点：为了提高蛋白质的鉴定率和定量率，需要用Trypsin以外的酶切断。ICPL Workflow (技术流程)补充、ICPL Reagent Structure，27、Acid Cleavable ICAT Reagents (ABI )补充、

9、优点：删除亲和基因标记的肽段分子量c标记为共流出时间一致缺点：几乎和ICAT试剂一样。、28、SILAC Workflow (技术流程)补充(stableisotopelabelingwithaminoacidsincellculture )，优点：省去体外标记化学反应和分离纯化工艺，与有助于低丰度蛋白质检测的传统蛋白质分离手段完全兼容缺点：不能对组织样品进行分析定量。 培养细胞在富含稳定同位素的介质中生长，可能影响细胞的繁殖，从而改变蛋白质的表达水平。 很贵。 不适用于人体样品。29、enzymatic labeling : trypsincatalyzedo 16 too 18 excha

10、nge补充，优点： MS/MS扫描时容易识别y系列离子。 简单，速度。 完全被标记，没有倾向。 翻译后的修饰信息不会丢失。 缺点：不稳定。 完全标记后的肽段只有4Da不同。 30、标签自由策略：扩展目标(xic ) -基本质量补充，优点：可以准确定量。 不需要标记，任何样品都可以定量。 不会丢失修饰信息。 缺点：样品定量分析时容易出错。 需要并行的2次实验，对机器、环境等的要求很高。 不合适时，将两个独立的样品进行多次精制。31、peptideionsfrommoreabundantproteinswouldbeselectedmorefrequentlyinmsspectrum .LC-MS

11、/MS、 spectralcountsornumberofpeptidesidentifiedforeachprotein，根据spectral counts的数目直接推定丰度，或者根据公式计算丰度值，例如： emPAI=10PAI-1， wherepaiisthenumberofobservedpeptidesdividedbythenumberoftheoreticallyobservablepeptides.m.mannetalmcp4. 91265-1272 semiquant ts补充，优点：简单，直接在单个复杂样品中使用蛋白质间的相对定量的不同样品，不同LC-MS/MS之间的比较不

12、准确。 启动HUPO人蛋白质组学项目(HumanProteome Project，HPP )，HPP的主要研究目的：鉴定人基因组编码的所有蛋白质及其功能。 构成各种人类组织的不同细胞类型的蛋白质表达谱蛋白质组学翻译后的修饰谱蛋白质组学的亚细胞局部图蛋白质-蛋白质相互作用的关系图蛋白质结构和功能的关联图，34， HPP的第一个执行修订计划：人血浆蛋白质组修订计划(Human Plasma Proteome Project，HUPO PPP )人肝脏蛋白质组修订计划(Human Liver Proteome Project )， HLPP HUPO PPP由美国科学家Gilbert Omenn领导

13、参与10多个国家/地区、57个实验室，HUPO PPP，35，HUPO PPP的前沿(pilot phase )目标：探讨不同样品的收集、处理和贮藏过程对蛋白质分析的影响通过分析血浆蛋白质组，比较不同蛋白质组分析技术平台的敏感性和局限性。 不同高丰度蛋白去除(depletion )方法和有无去除对蛋白鉴定的影响比较数据提取、整理和贮藏标准化，目的：人正常血浆/血清中全表达蛋白全表达蛋白在不同生理条件下的变异度，HUPO PPP，36，人血浆/血清蛋白组学研究的特殊意义，Gilbert 即，生物体中的各细胞可以反映其生理状态进行记录，作为排泄物或信号分子释放到血液中的人血液中的蛋白质是发现与各种疾病相关的已知和/或未知生物标记的最有价值的标本，通常的血液检查只能反映血液所具有的信息的很小一部分。 在疾病的早期诊断方面，虽然希望发现更有效的疾病标识，但迄今为止公认的新疾病标识数量极少。38、人血浆蛋白质的总情况是，血浆含有约7%的蛋白质、1%的其它物质、92%的水分。 这些蛋白质包括维持机体正常生理状态的蛋白质、各种病理、生理状态下机体细胞和组织分泌、脱落的蛋白质，血