抗植物病虫害基.ppt

1、第一章抗植物病虫害基因及其应用，第一节抗植物害虫基因及其应用第二节抗植物病毒基因及其应用第三节抗植物真菌病害基因及其应用第四节抗植物细菌病害基因及其应用2 .提高产量和质量。 3 .降低生产成本。 4 .防止化学农药污染，避免损害生态平衡。 5 .克服亲本基因资源不足。 6 .抗性性状具有连续性和整体性。 二、抗性基因的来源，根据基因的来源分为3类：1.胰蛋白酶抑制剂基因等植物组织。 2 .杀菌肽(cecropins )基因等动物。 3.Bt杀虫结晶蛋白基因等微生物。 三、抗性基因的分类根据基因的作用功能和对象分为：1.抗虫基因。 2 .抗病毒基因。 3 .抗真菌和细菌基因。 第二节抗植物害虫

2、基因及其应用、一、Bt基因及其应用二、蛋白酶抑制剂基因及其应用三、植物凝集素基因及其应用四、淀粉样变性抑制剂基因及其应用、一、Bt基因及其应用、Bt基因的作用原理2 结构及抗虫谱Bt基因的应用4 .问题及Bt基因：从微生物苏云金杆菌(Bacillus thu-ringicnsis )中分离的苏云金杆菌杀虫结晶蛋白基因，简称Bt基因。 苏云金杆菌以革兰氏阴性形成孢子细菌。 在胞子形成过程中，可生成由一种或多种蛋白质构成、具有特异杀虫活性的伴胞结晶，该蛋白质一般为-内毒素(-endotoxins )或杀虫结晶蛋白质(in-secticidal crysta1 protein， iccins )的作

3、用原理： ICP通常以原生素(protoxin )形式存在，昆虫摄食ICP后，原生素在昆虫消化道内被活化，转化为毒性多肽分子。 活化的ICP与昆虫肠道上皮细胞上的特异结合蛋白结合，全部或部分嵌合在细胞膜上，使细胞膜产生一些细孔，细胞因渗透平衡不良破坏而破裂。 昆虫的幼虫停止吃饭，终于死亡了。 ICP的活化过程：首先ICP溶解于昆虫肠道(ICP在碱性条件下可溶，在中性条件下不溶)，然后在蛋白酶的作用下，特异性蛋白酶水解切断使ICP活化。 活化的ICP不会被胰蛋白酶和其他蛋白酶破坏。 2ICP的分类、结构和抗虫光谱按抗虫光谱和序列同源性可分为4种类型：I (Cry I)抗鳞翅目昆虫对幼虫有特异毒性

4、作用。 类型(cry)抵抗鳞翅目和双翅目(Diptera )。 类型(cry)抗鞘翅目(Coleoptera )昆虫。 类型IVw(CryIV )抗双翅目(Diptera )昆虫。类型V(CryV )抵抗鳞翅目和鞘翅目。 近年来，Payne等人发现了具有抗膜翅目(Hymeno-ptera )和抗线虫(Nematodes )的ICP。 然后，在每个主要类型中，数组同步性使得ICP还被分类为一些子类，例如，CryI还被分类为IA(a )、IA(b )、IA(c )、I B、IC等。 ICP的结构是，Cry蛋白为长11001200氨基酸的多肽，大小为130140kD，其毒性多肽分子约为6070kD的

5、核片段。 有源区位于氨基端，但原毒素羧基端的至少一半以上的氨基酸序列没有毒性功能。 只要保留编码毒性核片段的核苷酸序列，就能达到抗虫目的。 例如，Bt2编码的最短毒性片段位于29至607氨基酸残基，再从基因3端删除4个密码子(codon )或从5端删除8个密码子，产物的毒性功能就完全丧失。 3. Bt基因的应用，1987年比利时的Vacek等人利用农杆菌介导法首次获得了转基因烟草株。 他们用全长的CryIA(b )基因编码了1155个氨基酸及其基因，留下了编码5末端病毒蛋白核心区的缺失片段(编码610个氨基酸)。 转基因植株对烟草天蛾(Manduca Sexta )幼虫的抗性为75100。美国

6、Monsanto公司的Fischhoff等人(1987年)获得了转换了Bt基因的西红柿株。 他们用拥有CaMV35S启动子的CryIA(b )基因转化了番茄系VF36。 得到了对烟草天蛾显示高抗虫活性的转基因植株。 但是，ICP的表达水平较低，对西红柿粉螟的抵抗性不强。 目前世界上有许多不同种类的ICP基因转入多种作物，如烟草、西红柿、玉米、棉花、水稻、苹果、核桃等。 研究结果表明，一般用全长CryIA基因转化植物，ICP在转化植物中表达量低、检测不出、抗虫效果差或无抗虫性。 在高抗虫性的转基因植株中，可溶性蛋白每1毫克约有2.6190ng的ICP。 4 .存在问题和对策： (1) ICP在植

7、物中表达水平低；(2)昆虫对ICP具有抵抗性；(3)抗菌谱狭窄；(1) ICP在植物中表达水平低；原因：主要是mRNA不稳定，翻译效率低。 天然的Bt基因富含a、t碱基，而植物基因富含g、c碱基，可能导致Bt基因转录的最终成熟终止(prematuretranscriptiontermination )和不适当的切断。 由于密码子的差异，Bt基因在植物细胞的转录过程中形成次级结构，mRNA的特定序列分解，翻译效率也可能降低。 为了提高富含a、t碱的Bt基因在富含g、碱的植物细胞中的表达水平。 有些人部分和完全修饰了CryI基因。 修饰的CryI基因在转基因棉、烟草、西红柿、玉米中的表达水平显着提

8、高。 对策1 :修饰Bt基因，改造密码子。 Monsanto公司的Per1ak等人在不改变氨基酸序列的情况下，对CryIA(b )和CryIA(c )基因进行了修饰(主要除去富含a、t的碱基序列)，对策2 :新的启动子(组织特异性启动子的一部分氨基酸，使用适合在玉米中表达的密码子代替由野生型CryIA(b )基因和只有65的同源性的g，c碱基丰富的CryIA(b )基因合成的原细菌密码子。 用基因枪将该基因导入玉米品种。 3种启动子：1.使用1. CaMV35S启动子。 2 .玉米磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(PEPCase )启动子。 3 .玉米花粉特异性启动子调控。 后者启动子调控下的CryIA(

9、b )基因在转基因玉米株中显示明显的组织特异性。 即在绿色组织中，CryIA(b )基因表达强烈，占可溶性蛋白010.4。 对策3 :寻找新一代启动子，除组织特异性启动子外，研究人员也寻找第二代启动子，提高ICP基因的表达水平。 例如，1，5 -二磷酸核酮羧化酶的小亚基启动子和叶绿体转运子可以将转基因烟草中的CryIA ()表达量提高10-20倍。 (2)昆虫对ICP具有耐药性，对策1 :采用组织特异性或化学诱导启动子。 使用组织特异性启动子可将Bt基因的表达限定在植物的重要组织。 例如，只在棉花棉铃中表达，最终选择的害虫可以在叶子上生存。 病原相关蛋白(pathogen-sis-relate

10、d PRotein，即pr蛋白)是植物感染病原体或受到其他刺激时表达的组蛋白。 PR-la是编码PR蛋白之一的基因，可以由感染诱导，也可以由化学刺激物质(包括水杨酸和聚丙烯酸)诱导。 目前，CIBA研究组携带PR- la启动子获得了调控Bt基因的转基因烟草。 用化学药品处理该基因的烟草对烟草天蛾有抗性。 因此，采用上述化学诱导启动子的方法可以控制Bt基因在化学诱导剂的存在下表达，降低抗性选择压的产生，防止抗性扩散。 对策2 :修饰Bt基因，使ICP在植物中高剂量表达。迄今发现的高水平Bt抗性基因均为隐性基因，且ICP对害虫幼虫尤其有效，因此，Bt基因的连续、高剂量表达可以消除突变杂合子。 对策

11、3 :使用2种以上的Bt基因或Bt与其他抗虫基因组合使用。 抗性位点的出现频率高，除毒蛋白质的投用量低到杂合体可以生存的程度外，昆虫几乎不可能同时对2种独立杀虫蛋白质具有抗性。 对策4 :与非转基因植株混种，在繁殖组留下部分最终选择的害虫，防止害虫对Bt基因的抗性扩散。 (3)抗菌谱狭窄，对策：采用多基因导入策略，利用基因间的协同菌作用，将多个基因同时导入植物体内。 二、蛋白酶抑制剂(PI )基因及其应用、1. PI基因的抗虫原理2. PI的分类和抗虫谱3. PI基因的应用是一种蛋白质，在植物防御昆虫和病原体感染的天然防御系统中起着重要作用，是具有明显抗虫作用的蛋白质。 PI基因的抗虫光谱广泛

12、，能抵御几种目的昆虫。 蛋白酶抑制剂(proteinase in- hibitor，PI ) :PI存在于自然界的所有生命体中，许多植物的种子和块茎中的含量可达到总蛋白质的1-10。 有些果实中氨基蛋白酶抑制剂的含量可达总蛋白质的30。 1、pi基因的抗虫原理，(1)PI与昆虫消化道内的蛋白消化酶结合形成酶抑制剂复合体(e )，从而阻断或减弱蛋白酶对外源蛋白质的水解作用，蛋白质不能正常消化。 (2)EI复合物刺激昆虫分泌过多消化酶，使昆虫发生厌食反应。 停止饮食，代谢所需的氨基酸不足，昆虫的发育异常或死亡。 (3)蛋白酶抑制剂分子通过消化道进入昆虫血淋巴系统，严重干扰昆虫蜕皮过程和兔疫病功能，

13、可能导致昆虫不能正常发育。 PI的作用特点： (1)PI作用于蛋白消化酶的活性中心。 活性中心是酶最保守的部位，发生突变的可能性极小，能够排除害虫因突变而产生抗药性的可能性。 (2)PI对人、畜无害，人、畜和昆虫的消化机制明显不同。 人畜蛋白消化酶主要存在于肠道，而PI在胃中的酸性条件下被胃蛋白酶分解。 2. PI的分类和抗虫光谱，植物有： (1)丝氨酸蛋白酶抑制剂；(2)巯基蛋白酶抑制剂；(3)金属蛋白酶抑制剂；(1)丝氨酸类蛋白酶抑制剂，许多昆虫使用的蛋白酶是丝氨酸类特别是胰蛋白酶大豆胰蛋白酶抑制剂(CpTI )、马铃薯蛋白酶抑制剂(patato inhibitor，PI )、大豆胰蛋白酶

14、抑制剂(CpTI ) :抗虫光谱广，抗虫效果最理想。 抗鳞翅目、鞘翅目和直翅目。 CpTI是由80个氨基酸组成的小分子多肽，分子中二硫键丰富，其中一个分子具有两个抑制活性中心。 CpTI与胰蛋白酶密切结合，使酶活性中心失活。 马铃薯蛋白酶抑制剂(patato inhibitor，pi):PI-I家族和PI-II家族，pi-i家族：含有马铃薯和番茄蛋白酶抑制剂I，其成熟肽单体分子量为8.1kD，只有一个PI-II比pi-i具有抗虫效应对烟草天蛾等一龄幼虫的抵抗性明显。 (2)巯基蛋白酶抑制剂对用巯基蛋白酶消化植物蛋白的昆虫具有特殊的抵抗性。 水稻巯基蛋白酶抑制剂(oryzacystatin )是

15、抗虫能力强的PI。其基因序列内有2个内含子，cDNA是编码102个氨基酸的肽，分子量约为15kD，分子中部52位后的lnvalvalalagly具有高度的维护性，该维护区域是维持抑制剂活力所必需的。 3 .蛋白酶抑制基因的应用，1987年，英国Durham大学的Hilder等人获得了将编码CpTI的cDNA转移到烟草品种Sam-sun NN，首先转移CpTI基因的工程株。 此cDNA的长度为550bP，由CaMV35S启动子控制。 所得烟草转基因株能够正确表达CpTI基因，部分转基因株中CpTI的表达量高达9.6gmg可溶性蛋白。 另一方面，当CpTI的表达量达到可溶性蛋白5gmg时，转基因株

16、显示出明显的抗虫性。 CpTI基因目前已转化为水稻、油菜、甘薯、苹果、杨树等许多重要的有经济价值的植物。 目前，已克隆了许多种蛋白酶抑制剂的基因和cDNA，其中有些具有明显的抗虫作用。 CpTI基因、PI-II基因和水稻巯基蛋白酶抑制基因在植物抗虫基因工程中应用最广泛，是研究较深的蛋白酶抑制基因。 提高PI基因表达水平的对策：深入研究基因表达的调控机制。 使用特定的启动子修饰蛋白酶抑制基因。 中国科学院遗传研究所用不同的启动子和因子修饰了CpIT基因，得到了不同的植物表达质粒。 其中的因子来源于烟草花叶病毒(TMV)126kD蛋白基因转录序列5末端的非转录区，由68bp组成，可促进mRNA的翻译。 利用受CaMV35S启动子串联因子控制的CpTI基因转化烟草，可显着提高转化烟草中CpTI的表达，但高效表达容易引起转化烟草白化。 三、植物凝集素基因及其应用，1 .基本特性2 .主要种类3 .抗虫原理4 .基因应用，1 .基本特性，植物凝集素(lectin )是来自非兔疫病的糖蛋白或结合糖蛋白(sugar-binding protein )主要是细胞的蛋白质最主要的特性是能与糖类结合。 多为低聚体