课题2　土壤中分解尿素的细菌的分离与计数.ppt

1、课题2：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数,生物备课组：龚珍珍,上一节课我们已经学习了培养基的配制以及接种技术，现在我们就来学习如何从土壤中将我们需要的微生物进行分离。,尿素是一种重要的农业氮肥，分子式为H2NCONH2，不能直接被农作物吸收。,土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才能被植物利用。,原因:,土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶,一、研究思路,二、实验设计,三、结果分析与评价,四、课题延伸,你能想一想怎样能将分解尿素的细菌从土壤中分离出来吗？,想一想,（一）筛选菌株,一 研究思路,温泉,冰川,分解石油的细菌,油田,筛选原则： 根据微生物对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。,实例：

2、Taq DNA聚合酶的发现,DNA多聚酶链式反应是一种在体外将少量DNA大量复制的技术。此项技术的自动化，要求使用耐高温的DNA聚合酶，该去哪里寻找？,科学家是从水生耐热细菌 Taq中分离到耐高温的Taq DNA聚合酶的。,美国黄石国家公园的一个热泉,2、选择培养基,定义,允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，叫做选择培养基。,选择培养基配方,在左图的培养基配方中，碳源和氮源分别是什么？,碳源葡萄糖、 尿素,氮源尿素,1、显微镜直接计数：,利用血球计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。,不能区分死菌与活菌； 个体小的细菌在显微镜下难以观察；,缺点,（

3、二）统计菌落的数目,2、稀释涂布平板法（活菌计数法）,原理： 当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。,恰当的稀释度是成功统计菌落数目的关键。,样品稀释培养示意图,选 30300 个菌落的平板统计。 每个稀释度取3个平板取其平均值。 统计的菌落往往比活菌的实际数目低。,每克样品中的菌落数(CV)M C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)，M代表稀释倍数。,是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。,（三）设置对照：,（1）设置对照的目的：,（2）对照实验：,指除了被测试的条件外，其他条件

4、都相同的实验。,实验组： 对照组：设置对照 - 同等条件下，培养空白培养基。,实例：在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌落数目的实验时，A同学从对应的106倍稀释的培养基中筛选出大约150个菌落，但是其他同学在同样的稀释度下只选择出大约50个菌落。分析其原因。,原因： 土样不同， 培养基污染或操作失误(或者是混入了其他的含氮物质),小结： 通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。,方案一：由其他同学用与A同学相同土样进行实验,方案二：将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。,结果预测： 如果结果与A同学一致，则证明A无误；如

5、果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。,二 实验设计,实验具体操作步骤：,1、土壤取样 从富含有机物、潮湿、酸碱度适中的土壤中取样。铲去表层土3cm左右，取样，将样品装入事先准备好的信封中。,“微生物的天然培养基”,数量最大、种类最多,大约70%90%是细菌,制备选择培养基（尿素为唯一氮源） 制备牛肉膏蛋白胨培养基,（对照作用）,思考？为什么还要制备牛肉膏蛋白胨培养基？,2、制备培养基,3、样品的稀释,分离不同的微生物采用不同的稀释度 原因：不同微生物在土壤中含量不同 目的：保证获得菌落数在30300之间、适于计数的平板,（1）测细菌数：一般用104、105、106稀释液

6、（2）测放线菌：一般用103、104、105稀释液 （3）测真菌数：一般用102、103、104稀释液,按浓度捆成一摞,恒温37培养,4、微生物的培养与观察,培养不同微生物往往需要不同培养温度。,细菌：3037培养12d 放线菌：2528培养57d 霉菌：2528的温度下培养34d。,观 察,1、在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目。 选取菌落数目稳定时的记录作为结果， 这样以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。 2、以“稳定菌落”为观察对象。 原因：不同种类的细菌形成的菌落，在大小、形状、光泽度、颜色、硬度、透明度等方面具有一度的特征，菌落特征可作为菌种鉴定的重要依据。,不同形态的菌落,不同形态的菌落,（一）培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出菌落 对照的培养皿在培养过程中没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染。牛肉膏培养基的菌落数目明显大于选择培养基的数目，说明选择培养基已筛选出一些菌落。 （二）样品的稀释操作是否成功 如果得到了2个或2个以上菌落数目在30300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数。 （三）重复组的结果是否一致 如果学生选取的是同一种土样，统计的结果应该接近。如果结果相差太远，教师需要引导学生一起分析产生差异的原因。,结果分析与评价,pH升高 指示剂（酚红）将变红,课题延伸,研究思路,实验设计,筛选菌株,选