免疫学检验-单克隆抗体与基因工程抗体的制备技术.ppt

1、单克隆抗体与基因工程抗体的制备技术,本节课主要内容,一、抗体分子的结构 二、细胞工程抗体和基因工程抗体 三、治疗性单抗研制进展,Fc,Fab,一 抗体分子结构,V:variable; C:constant; H:heaven; L:light,CDR: Complement Determinant Region,CDR,Epitope,二、细胞工程抗体和基因工程抗体,第一代：多克隆抗血清 第二代：细胞工程抗体 第三代：基因工程抗体,抗体技术的发展经历了三个阶段, 多克隆抗血清,对健康人用疫苗进行主动免疫，免疫前（a）和免疫后10天 （b）分别采血并对血清蛋白进行凝胶电泳分析。免疫前血清中的g

2、球蛋白条带较宽，免疫之后则相对集中。Bruton 氏病患者血清蛋白中的 球蛋白条带缺失（c）。,多价抗原,单克隆 （致敏的B细胞）,多克隆抗体,单克隆抗体,基本原理：细胞工程抗体制备,杂交瘤细胞,单克隆抗体,HAT: 次黄嘌呤(H),氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T) HGPRT：次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转化酶,蛇毒单抗的制备,抗血清,单克隆抗体,基因工程抗体,破伤风抗血清,抗肿瘤 (鼠 , 人-鼠 ),抗肿瘤 , 自身免疫病,不同类型的抗体对人们生活的影响,基因工程抗体,通过基因重组改良抗体性能,Susumu Tonegama,1987, structure of Ig gene,小分子抗体

3、人源化抗体 抗体融合蛋白,Ig基因及其重排,V V V V V V V V J J J J J K 着丝粒 V V V V,V V VPREB1 V V J1 L1 J2 L2 J3 L3 J4 L4 J5 L5 J6 L6 J7 L7 IGLL1 IGLL2 IGLL3,免 疫 球 蛋 白 基 因 结 构,IGK （位于染色体 2p12-p11）,1.85M b,0.85M b,多于90个 IGKV,5个 IGKJ,IGKC,11个 IGKV orphons,IGL （位于染色体 22q11）,60个 IGLV, 800K b,14K b,60K b,670Kb,30Kb,150Kb,7个

4、IGLJ 与 7个 IGLC 交替排列,3个 IGLL 基因座, 小分子抗体,1,2,3,大肠杆菌表达；容易穿透；不含Fc,副作用小；半衰期短，有利于毒素的中和和清除,Diabody structure,CTL,CD3,TUMOR CELL,-S-S-,抗原A,抗原B,双特异性抗体, 抗体融合蛋白,抗原结合部位Fab与生物活性蛋白结合 免疫导向：与毒素、细胞因子结合 嵌合受体：与细胞膜结合 免疫桥连 含Fc段的抗体融合蛋白 延长血清中半寿期 生物学效应功能：ADCC、CDC 免疫黏附素：与CD4结合, 鼠单抗人源化,恒定区人源化人-鼠嵌合抗体 可变区人源化人改型抗体 用抗体库技术进行人源化,鼠

5、单抗人源化,Pr 鼠VH 人 CH Pr 鼠VL 人 CL,免疫球蛋白 基因载体的构建,H链嵌合载体,L 链嵌合载体,共转染细胞,启动子,人-鼠嵌合抗体(human mouse chimeric antibody),鼠VH,鼠VL,人CL,人CH,抗体分泌细胞,人-鼠嵌合基因工程抗体,鼠单克隆抗体V区的人源化,人改型抗体（CDR移植）,人源化抗体（humanized antibody）又称CDR移植抗体（CDR grafting antibody）,CDR序列,CDR序列,鼠单克隆抗体,人抗体,人源化抗体（该型抗体）,图4 鼠单克隆V区人源化（CDR移植）,1 小分子抗体,3 人源化抗体,基因

6、工程改造的抗体,2,抗体库技术,基因克隆全套抗体重链和轻链可变区基因, 基因工程方法研制新的单抗,重组基因到表达载体（嗜菌体或质粒）,大肠杆菌直接表达有功能的抗体分子片段,筛选特异的可变区基因,抗体库技术产生的三项技术基础, RT-PCR：能够克隆全套抗体可变区基因 抗体基因片段在大肠杆菌的功能性表达 噬菌体展示技术（phage display),噬菌体抗体图示,大肠杆菌,外壳蛋白,噬菌体,抗体库的构建,抗体库的富集筛选,三、治疗性单抗研制进展,TUMOR CELL,Fab,免疫毒素( 植物和细菌 ) 同位素( I131, I125, In111 ) 抗体导向化学疗法（甲氨喋呤,长春新碱,阿霉

7、素） 裂解药物的酶,抗体标记,-S-S-,Tumor cell,enzyme,抗体与酶分子偶联,prodrug,drug,enzyme,表 已批准上市的治疗性单抗,2001,淋巴瘤,CD52,人源化抗体,Campath,2000,淋巴瘤,CD33,人源化抗体化疗药物交联物,Mylotarg,1998,移植排斥,兔多抗,Thymogloblin,1998,RSV感染,RSV F蛋白,人源化抗体,Synagis,1998,乳腺癌,HER-2,人源化抗体,Herceptin,1998 1999,炎症性肠病类风湿关节炎,TNF-,人-鼠嵌合抗体,Remicade,1998,移植排斥,CD25,人-鼠嵌合抗体,Simulect,1997,淋巴瘤,CD20,人-鼠嵌合抗体,Rituxan,1997,移植排斥,CD25,人源化抗体,Ze